Proteinase K mNGS (ຂອງແຫຼວ)
Proteinase K ແມ່ນ protease serine ທີ່ຫມັ້ນຄົງທີ່ມີຄວາມສະເພາະຂອງ substrate ຢ່າງກວ້າງຂວາງ.ມັນ degrades ທາດໂປຼຕີນຈໍານວນຫຼາຍຢູ່ໃນລັດພື້ນເມືອງເຖິງແມ່ນວ່າຢູ່ໃນທີ່ປະທັບຂອງ detergents.ຫຼັກຖານຈາກການສຶກສາໂຄງປະກອບການໄປເຊຍກັນແລະໂມເລກຸນຊີ້ບອກ enzyme ເປັນຂອງຄອບຄົວ subtilisin ທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວ catalytic triad (Asp.39- ລາວ69-ເຊີ224).ສະຖານທີ່ເດັ່ນຂອງການແຕກແຍກແມ່ນພັນທະບັດ peptide ຕິດກັບກຸ່ມ carboxyl ຂອງອາຊິດ amino aliphatic ແລະມີກິ່ນຫອມທີ່ມີກຸ່ມ alpha amino ທີ່ຖືກສະກັດ.ມັນຖືກນໍາໃຊ້ທົ່ວໄປສໍາລັບການສະເພາະຢ່າງກວ້າງຂວາງຂອງມັນ.ໂປຣຕີນ K ນີ້ຖືກອອກແບບມາເປັນພິເສດສໍາລັບ mNGS.ເມື່ອປຽບທຽບກັບທາດໂປຼຕີນ K ອື່ນໆ, ມັນມີການປົນເປື້ອນອາຊິດນິວຄລີອິກ ໜ້ອຍ ລົງດ້ວຍປະສິດທິພາບຂອງເອນໄຊດຽວກັນ, ເຊິ່ງສາມາດຮັບປະກັນການ ນຳ ໃຊ້ mNGS ລຸ່ມ.
ເງື່ອນໄຂການເກັບຮັກສາ
2-8℃ ສໍາລັບ 2 ປີ
ຂໍ້ມູນຈໍາເພາະ
| ຮູບລັກສະນະ | ແຫຼວທີ່ບໍ່ມີສີຫາສີນ້ຳຕານອ່ອນ |
| ກິດຈະກໍາ | ≥800 U/ml |
| ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນ | ≥20 mg/ml |
| Nickase | ບໍ່ກວດພົບ |
| ດີນາສ | ບໍ່ກວດພົບ |
| RNase | ບໍ່ກວດພົບ |
ຄຸນສົມບັດ
| ໝາຍເລກ EC | 3.4.21.64(ຜະສົມຜະສານຈາກອະລະບໍ້າ Tritiracium) |
| ຈຸດ isoelectric | 7.81 |
| pH ທີ່ດີທີ່ສຸດ | 7.0- 12.0 ຮູບ 1 |
| ອຸນຫະພູມທີ່ດີທີ່ສຸດ | 65 ℃ ຮູບ 2 |
| ສະຖຽນລະພາບ pH | pH 4.5- 12.5 (25 ℃, 16 h) ຮູບ 3. |
| ຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງຄວາມຮ້ອນ | ຕ່ໍາກວ່າ 50 ℃ (pH 8.0, 30 min) ຮູບ 4 |
| ຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງການເກັບຮັກສາ | ຫຼາຍກວ່າ 90% ກິດຈະກໍາສໍາລັບ 12 ເດືອນຢູ່ທີ່ 25 ℃ |
| ຕົວກະຕຸ້ນ | SDS, urea |
| ຢາຍັບຍັ້ງ | Diisopropyl fluorophosphate;phenylmethylsulfonyl fluoride |
ຄໍາຮ້ອງສະຫມັກ
1. ຊຸດກວດພະຍາດທາງພັນທຸກໍາ
2. ຊຸດສະກັດ RNA ແລະ DNA
3. ການສະກັດເອົາອົງປະກອບທີ່ບໍ່ແມ່ນທາດໂປຼຕີນຈາກເນື້ອເຍື່ອ, ການເຊື່ອມໂຊມຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ impurities ເຊັ່ນ DNA.ວັກຊີນແລະການກະກຽມ heparin
4. ການກະກຽມຂອງໂຄໂມໂຊມ DNA ໂດຍ electrophoresis pulsed
5. blot ຕາເວັນຕົກ
6. Enzymatic glycosylated albumin reagents in vitro ການວິນິດໄສ
ການປ້ອງກັນລ່ວງໜ້າ
ໃສ່ຖົງມືແລະແວ່ນຕາປ້ອງກັນໃນເວລາໃຊ້ຫຼືຊັ່ງນໍ້າຫນັກ, ແລະຮັກສາລະບາຍອາກາດໄດ້ດີຫຼັງຈາກການນໍາໃຊ້.ຜະລິດຕະພັນນີ້ອາດຈະເຮັດໃຫ້ເກີດອາການແພ້ຕໍ່ຜິວຫນັງແລະການລະຄາຍເຄືອງຕາທີ່ຮ້າຍແຮງ.ຖ້າຫາຍໃຈເຂົ້າ, ອາດຈະເຮັດໃຫ້ເກີດອາການແພ້ ຫຼື ອາການຫືດ ຫຼື ຫາຍໃຈຝືດ.ອາດຈະເຮັດໃຫ້ເກີດການລະຄາຍເຄືອງທາງຫາຍໃຈ.
ນິຍາມຫົວໜ່ວຍ
ຫນຶ່ງຫນ່ວຍ (U) ຖືກກໍານົດເປັນຈໍານວນ enzyme ທີ່ຕ້ອງການເພື່ອ hydrolyze casein ການຜະລິດ 1 μmol.tyrosine ຕໍ່ນາທີພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້.
ການກະກຽມ reagents
Reagent I: casein ນົມ 1g ຖືກລະລາຍໃນ 50ml ຂອງ 0.1M sodium phosphate solution (pH 8.0), incubated in 65-70 ℃ water for 15mins, stirred and dissolved, cooled by water, adjusted by sodium hydroxide to pH 8.0, ແລະປະລິມານຄົງທີ່. 100ml.
Reagent II: 0.1M trichloroacetic acid, 0.2M sodium acetate, 0.3M ອາຊິດ acetic.
Reagent III: 0.4M Na2CO3ການແກ້ໄຂ.
Reagent IV: Forint reagent diluted with pure water for 5 ເທື່ອ.
Reagent V: Enzyme diluent: 0.1M sodium phosphate solution (pH 8.0).
Reagent VI: ການແກ້ໄຂ tyrosine: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml tyrosine ທີ່ລະລາຍດ້ວຍ 0.2M HCl.
ຂັ້ນຕອນ
1. 0.5ml ຂອງ reagent I ແມ່ນ pre- warmed ກັບ 37℃, ເພີ່ມ 0.5ml ຂອງ enzyme solution, ປົນກັນ, ແລະ incubate ຢູ່ທີ່.37 ℃ສໍາລັບ 10 ນາທີ.
2. ຕື່ມ 1ml ຂອງ reagent II ເພື່ອຢຸດຕິກິຣິຍາ, ປົນກັນ, ແລະສືບຕໍ່ incubation ສໍາລັບ 30 ນາທີ.
3. ການແກ້ໄຂປະຕິກິລິຍາ centrifugate.
4. ເອົາ 0.5ml supernatant ຕື່ມ 2.5ml reagent III, 0.5ml reagent IV, ປົນກັນແລະ incubate ຢູ່ທີ່ 37 ℃.ສໍາລັບ 30 ນາທີ.
5. OD660ຖືກກໍານົດເປັນ OD1;ກຸ່ມຄວບຄຸມເປົ່າ: 0.5ml reagent V ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອທົດແທນ enzymeການແກ້ໄຂເພື່ອກໍານົດ OD660ເປັນ OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. ເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານ L-tyrosine: 0.5mL ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນທີ່ແຕກຕ່າງກັນ L-tyrosine solution, 2.5mL Reagent III, 0.5mL Reagent IV in 5mL centrifuge tube, incubate in 37℃ for 30mins, detect for OD660ສໍາລັບຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ L-tyrosine ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ, ຫຼັງຈາກນັ້ນໄດ້ຮັບເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານ Y = kX + b, ບ່ອນທີ່ Y ແມ່ນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ L-tyrosine, X ແມ່ນ OD600.
ການຄິດໄລ່
2: ປະລິມານທັງໝົດຂອງການແກ້ໄຂປະຕິກິລິຍາ (ມລ)
0.5: ປະລິມານການແກ້ໄຂ enzyme (mL)
0.5: ປະລິມານຂອງແຫຼວປະຕິກິລິຍາທີ່ໃຊ້ໃນການກໍານົດ chromogenic (mL)
10: ເວລາປະຕິກິລິຍາ (ນາທີ)
Df: dilution ຫຼາຍ
C: ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງເອນໄຊ (mg/mL)
ເອກະສານອ້າງອີງ
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77 .
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.ຊີວະປະຫວັດຫຍໍ້.Res.ຊຸມຊົນ.(1971);44:513 .
3. Hilz, H.et al.,ເອີ.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. ຊຳບຣຸກ ເຈet al., Molecular Cloning: ຄູ່ມືຫ້ອງທົດລອງ, ສະບັບທີ 2, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
ຕົວເລກ
ຮູບ.1 ດີທີ່ສຸດ pH
100mM buffer solution: pH6.0-8.0, Na-phosphate;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glycine-NaOH. ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງເອນໄຊ: 1mg/mL
Fig.2 ອຸນຫະພູມທີ່ດີທີ່ສຸດ
ປະຕິກິລິຍາໃນ 20 mM K-phosphate buffer pH 8.0.ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງເອນໄຊ: 1 ມກ/ມລ
Fig.3 pH ສະຖຽນລະພາບ
25 ℃, ການປິ່ນປົວ 16 h ກັບ 50 mM buffer solution: pH 4.5- 5.5, Acetate;pH 6.0-8.0, Na-phosphate;pH 8.0-9.0, Tris-HCl.pH 9.0- 12.5, Glycine-NaOH.ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງເອນໄຊ: 1 ມກ/ມລ
Fig.4 ຄວາມຮ້ອນ ສະຖຽນລະພາບ
ການປິ່ນປົວ 30 ນາທີດ້ວຍ 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0.ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງເອນໄຊ: 1 ມກ/ມລ
Fig.5 ການເກັບຮັກສາ ສະຖຽນລະພາບty at 25℃
