ຊຸດ PCR ໂດຍກົງຂອງພືດ
ໝາຍເລກແມວ: HCR2020A
Plant Direct PCR Kit ແມ່ນເຫມາະສົມສໍາລັບການຂະຫຍາຍໂດຍກົງຂອງໃບພືດ, ແກ່ນ, ແລະອື່ນໆ, ແລະສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການກວດສອບຜ່ານສູງຂອງຕົວຢ່າງພືດທີ່ບໍ່ມີ polysaccharides ແລະ polyphenols.ການຂະຫຍາຍ DNA polymerase ໂດຍກົງໂດຍອີງໃສ່ວິວັດທະນາການຊີ້ນໍາມີຄວາມທົນທານດີກວ່າ PCR inhibitors ໃນພືດ.ໃນຂະນະດຽວກັນ, ມັນຮັກສາປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍສູງ, ເຊິ່ງເຫມາະສົມສໍາລັບການຂະຫຍາຍຂອງຊິ້ນ DNA ພາຍໃນ 5 kb.Lysis buffer A ທີ່ເປັນເອກະລັກໃນຊຸດສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອ lyse ເນື້ອເຍື່ອພືດສົດຫຼືແຊ່ແຂງ.ມັນງ່າຍທີ່ຈະປະຕິບັດງານແລະ lysate ສາມາດນໍາໃຊ້ເປັນແມ່ແບບສໍາລັບການຂະຫຍາຍໂດຍບໍ່ມີການບໍລິສຸດ.ລະບົບປະກອບດ້ວຍສານປ້ອງກັນທີ່ຊ່ວຍໃຫ້ຕົວຢ່າງດິບສາມາດຂະຫຍາຍອອກໄດ້ຢ່າງມີປະສິດທິພາບຫຼັງຈາກການແຊ່ແຂງແລະ thawing ຊ້ໍາອີກຄັ້ງ.2 × Plant Direct Master Mix ພຽງແຕ່ຕ້ອງການເພີ່ມ primers ແລະ templates ເພື່ອປະຕິບັດປະຕິກິລິຍາການຂະຫຍາຍ, ດັ່ງນັ້ນການຫຼຸດຜ່ອນການດໍາເນີນງານ pipetting ແລະປັບປຸງ throughput ການຊອກຄົ້ນຫາແລະ reproducibility ຂອງຜົນໄດ້ຮັບ.
ອົງປະກອບ
| ອົງປະກອບ | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Plant Direct Master Mix | 1.25 ມລ | 4×1.25 ມລ |
| Plant Direct Lysis Buffer A | 5 ມລ | 20 ມລ |
| Plant Direct Lysis Buffer B* | 5 ມລ | 20 ມລ |
*Plant Direct Lysis Buffer B ແມ່ນທາດ reagent ທາງເລືອກ, ເຊິ່ງຖືກໃຊ້ເພື່ອ neutralize Plant Direct Lysis Buffer A ສໍາລັບການຍືດເວລາການເກັບຮັກສາຕົວຢ່າງ.ສາມາດນຳໃຊ້ໄດ້ຕາມສະພາບຕົວຈິງ.
ເງື່ອນໄຂການເກັບຮັກສາ
2 × Plant Direct Master Mix, ເກັບຢູ່ທີ່ -30 ~ -15℃ ແລະຫຼີກເວັ້ນການຊ້ໍາ freezing ແລະ thawing;Plant Direct Lysis Buffer, ເກັບຢູ່ທີ່ -30 ~ -15℃ ຫຼື 2 ~ 8℃.
ຂະບວນການທົດລອງ
ການປຸງແຕ່ງຕົວຢ່າງ–ໃບໄມ້
ວິທີການໂດຍກົງ:ມັນແນະນໍາໃຫ້ໃຊ້ໃບອ່ອນ.ໃຊ້ເຈາະຮູທີ່ມີເສັ້ນຜ່າສູນກາງຄົງທີ່ຂອງ 0.5 - 3 ມມເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຕົວຢ່າງຂະຫນາດນ້ອຍແລະເປັນເອກະພາບ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຕື່ມຕົວຢ່າງໂດຍກົງໃສ່ລະບົບ PCR (ແນະນໍາລະບົບ 50 μl).ຫມາຍເຫດ, ໃຫ້ແນ່ໃຈວ່າຕົວຢ່າງຢູ່ໃນການແກ້ໄຂ PCR ແລະບໍ່ຕໍ່ກັບກໍາແພງທໍ່.ຖ້າ PCR ໂດຍກົງຖືກໃຊ້ເພື່ອຂະຫຍາຍຊິ້ນສ່ວນຍາວແລະຕົວຢ່າງທີ່ສັບສົນ, ການໃຊ້ຕົວຢ່າງທີ່ມີເສັ້ນຜ່າກາງຂະຫນາດນ້ອຍກວ່າ (0.5 - 1 ມມ) ເປັນແມ່ແບບສາມາດຊ່ວຍໃຫ້ມີຜົນໄດ້ຮັບທີ່ດີກວ່າ.
ວິທີການ grinding lysis:ມັນແນະນໍາໃຫ້ໃຊ້ໃບອ່ອນ.ເອົາໃບນ້ອຍໆ (ເສັ້ນຜ່າກາງປະມານ 1 – 3 ມມ), ວາງໃສ່ໃນ 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, ແລະ ຕຳໃຫ້ຫຼາຍເທົ່າທີ່ເປັນໄປໄດ້ (ຂັ້ນຕອນນີ້ສາມາດເຮັດໄດ້ໂດຍການບີບໃບດ້ວຍປາຍທໍ່ 100 μl. ເພື່ອ mash ຕົວຢ່າງ).ຖ້າໃຊ້ເນື້ອເຍື່ອຂອງໃບໃຫຍ່ກວ່າ (ບໍ່ເກີນ 7 ມມ), ເພີ່ມປະລິມານຂອງ buffer dilution ເປັນ 50 μl.ຫຼັງຈາກໃບແມ່ນດິນ, ການແກ້ໄຂຄວນຈະເປັນສີຂຽວ.ຫຼັງຈາກ centrifugation ສັ້ນໆ, ເພີ່ມ 1 μlຂອງ supernatant ກັບລະບົບ PCR ເປັນແມ່ແບບຕິກິຣິຍາ .
ວິທີການລະດັບຄວາມຮ້ອນ:ມັນແນະນໍາໃຫ້ໃຊ້ໃບອ່ອນ.ເອົາໃບນ້ອຍໆ (ເສັ້ນຜ່າກາງປະມານ 1 – 3 ມມ), ວາງໃສ່ໃນ 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A, ແລະໃຫ້ຄວາມຮ້ອນຢູ່ທີ່ 95 ອົງສາ C ເປັນເວລາ 5 – 10 ນາທີ.ໄລຍະເວລາຂອງ lysis ສາມາດຂະຫຍາຍອອກໄດ້ຢ່າງເໝາະສົມສຳລັບໃບທີ່ລຳບາກຍາກ (ບໍ່ເກີນ 20 ນາທີ).ຖ້າໃຊ້ເນື້ອເຍື່ອຂອງໃບໃຫຍ່ກວ່າ (ບໍ່ເກີນ 7 ມມ), ເພີ່ມປະລິມານຂອງ buffer dilution ເປັນ 50 μl.ຫຼັງຈາກຄວາມຮ້ອນ, centrifuge ໄລຍະສັ້ນໆ, ແລະເພີ່ມ 1 μlຂອງ supernatant ກັບລະບົບ PCR ເປັນແມ່ແບບຕິກິຣິຍາ.
ການປຸງແຕ່ງຕົວຢ່າງ- ແກ່ນພືດ
ວິທີການ grinding lysis:ໃຊ້ scalpel ຕັດເມັດທີ່ມີເສັ້ນຜ່າກາງ 5 ມມ, ເພີ່ມພວກມັນໃສ່ 100 μlຂອງ Plant Direct Lysis Buffer A, ແລະ grind ຕົວຢ່າງດ້ວຍປາຍທໍ່ຫຼືເຄື່ອງມືອື່ນໆ.Vortex ໄລຍະສັ້ນໆແລະປ່ອຍໃຫ້ຢືນຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງສໍາລັບ 3 - 5 ນາທີ.ໃຫ້ແນ່ໃຈວ່າຕົວຢ່າງຂອງເມັດຖືກຈົມຢູ່ໃນບ່ອນປ້ອງກັນການເຈືອຈາງ.ຫຼັງຈາກ centrifugation ສັ້ນໆ, ເພີ່ມ 1 μlຂອງ supernatant ກັບລະບົບ PCR ເປັນແມ່ແບບຕິກິຣິຍາ.
ວິທີການລະດັບຄວາມຮ້ອນ:ໃຊ້ scalpel ຕັດແກ່ນທີ່ມີເສັ້ນຜ່າກາງ 5 ມມ, ເພີ່ມພວກມັນໃສ່ 100 μlຂອງ Plant Direct Lysis Buffer A, ແລະໃຫ້ຄວາມຮ້ອນຢູ່ທີ່ 95 ° C ເປັນເວລາ 5 - 10 ນາທີ.ໄລຍະເວລາຂອງ lysis ສາມາດຂະຫຍາຍອອກໄດ້ຢ່າງເໝາະສົມສຳລັບໃບໄມ້ທີ່ຍາກຕໍ່ການເກີດ (ບໍ່ເກີນ 30 ນາທີ).ຫຼັງຈາກຄວາມຮ້ອນ, centrifuge ໄລຍະສັ້ນໆ, ແລະເພີ່ມ 1 μl supernatant ກັບລະບົບ PCR ເປັນແມ່ແບບຕິກິຣິຍາ.
ກ.ມີດຕັດຫຼືເຄື່ອງມືອື່ນໆຍັງສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອຕັດຕົວຢ່າງຂອງຂະຫນາດທີ່ເຫມາະສົມ;ຖ້າດີໃຈຫລາຍຫຼືມີດຕັດຖືກນໍາມາໃຊ້ໃຫມ່, ພວກມັນຄວນຈະຖືກອະນາໄມດ້ວຍການແກ້ໄຂ sodium hypochlorite 2% ກ່ອນທີ່ຈະນໍາໃຊ້ແຕ່ລະຄັ້ງເພື່ອປ້ອງກັນການປົນເປື້ອນລະຫວ່າງຕົວຢ່າງ.
ຂ.ໃຫ້ແນ່ໃຈວ່າ Plant Direct Lysis Buffer ແມ່ນລະລາຍຢ່າງສົມບູນກ່ອນທີ່ຈະໃຊ້.ຖ້າ buffer ແມ່ນ viscous ຫຼືມີ precipitates, ມັນສາມາດໄດ້ຮັບການໃຫ້ຄວາມຮ້ອນຢູ່ທີ່ 37 ℃ເພື່ອເຮັດໃຫ້ມັນລະລາຍຫມົດກ່ອນທີ່ຈະນໍາໃຊ້.
ຄ.ປະລິມານຂອງແມ່ແບບໃນລະບົບຕິກິຣິຍາສາມາດປັບໄດ້ຕາມຄວາມເຫມາະສົມຕາມຄວາມແຕກຕ່າງຂອງປະລິມານຂອງວັດສະດຸພືດແລະ diluent ເພີ່ມ.
ພືດ Lysis Buffer ໂດຍກົງ
Plant Direct Lysis Buffer A ທີ່ມີຢູ່ໃນຜະລິດຕະພັນນີ້ໄດ້ຖືກປັບປຸງຢ່າງເຂັ້ມງວດເພື່ອປົດປ່ອຍ genome ຂອງເນື້ອເຍື່ອພືດສ່ວນໃຫຍ່ແລະເຫມາະສົມສໍາລັບການເກັບຮັກສາໄລຍະສັ້ນຂອງພືດດິບຢູ່ທີ່ 4 ℃.ຖ້າຕົວຢ່າງຕ້ອງການເກັບຮັກສາໄວ້ເປັນເວລາດົນກວ່າ (ຕົວຢ່າງ: 1 – 2 ເດືອນ), ແນະນໍາໃຫ້ໂອນ supernatant ໄປໃສ່ທໍ່ EP ໃຫມ່ແລະເກັບຮັກສາໄວ້ໃນ -20 ℃.ເພື່ອເກັບຮັກສາຕົວຢ່າງໃຫ້ຄົງທີ່ຫຼາຍ, ເພີ່ມປະລິມານທີ່ເທົ່າທຽມກັນຂອງ Plant Direct Lysis Buffer B ໃຫ້ກັບ supernatant ທີ່ຖືກໂອນ, ປະສົມໃຫ້ດີແລະເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -20 ℃.ເວລາເກັບຮັກສາທີ່ຫມັ້ນຄົງແຕກຕ່າງກັນກັບຕົວຢ່າງແລະລັດຂອງພືດ.
ລະບົບປະຕິກິລິຍາ
| ddH2O | ເຖິງ 20.0 µl | ເຖິງ 50.0 µl |
| 2 × Plant Direct Master Mixa | 10.0 µl | 25.0 µ |
| primer 1 (10 µM) | 0.8 µl | 2.0 µl |
| primer 2 (10 µM)b | 0.8 µl | 2.0 µl |
| ຕົວຢ່າງສານສະກັດຈາກໃບ/ໃບພືດ(ເບິ່ງການປະມວນຜົນຕົວຢ່າງ) | ແຜ່ນໃບ 0.5 – 3 ມມ/x µl | ແຜ່ນໃບ 0.5 – 3 ມມ/x µl |
ກ.ມັນປະກອບດ້ວຍ Mg2+ຢູ່ທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສຸດທ້າຍຂອງ 2 mM.
ຂ.ແນະນໍາໃຫ້ໃຊ້ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສຸດທ້າຍຂອງ 0.4μM ສໍາລັບແຕ່ລະ primer.ການນໍາໃຊ້ primers ຫຼາຍເກີນໄປຈະນໍາໄປສູ່ການຂະຫຍາຍໃຫຍ່ຂື້ນທີ່ບໍ່ສະເພາະ.
ຄ.ຈໍານວນຕົວຢ່າງທີ່ໃຊ້ສາມາດປັບຕົວໄດ້ຕາມສະຖານະການຕົວຈິງ.ປະລິມານທີ່ໃຊ້ໃນປະຕິກິລິຍາດຽວຂອງຕົວຢ່າງ lysed ດິບສາມາດປັບໄດ້ລະຫວ່າງ 2% - 20% ຂອງປະລິມານທັງໝົດຂອງປະຕິກິລິຍາ.ການນໍາໃຊ້ຕົວຢ່າງຫຼາຍເກີນໄປສາມາດເຮັດໃຫ້ເກີດຄວາມລົ້ມເຫຼວຂອງການຂະຫຍາຍ.
ໂຄງການປະຕິກິລິຍາ
| ຂັ້ນຕອນ | ອຸນຫະພູມ | ເວລາ |
| ລັກສະນະເບື້ອງຕົ້ນ | 98℃ | 5 ນທ |
| ລັກສະນະ | 95℃ | 10 ວິ |
| ການຫົດຕົວ | 58 ~ 72 ℃ | 15 ວິ |
| ສ່ວນຂະຫຍາຍ | 72 ℃ | 30 ວິ |
| ສ່ວນຂະຫຍາຍສຸດທ້າຍ | 72 ℃ | 5 ນທ |
ກ.Initial Denaturation (98℃, 5 min) ສົ່ງເສີມ lysis ຂອງເນື້ອເຍື່ອພືດ, ປ່ອຍ DNA genomic ທີ່ສາມາດໃຊ້ສໍາລັບການຂະຫຍາຍ PCR.ຢ່າເຮັດໃຫ້ເວລາສັ້ນລົງຫຼືຫຼຸດລົງອຸນຫະພູມ.
ຂ.ແນະນໍາໃຫ້ຕັ້ງມັນເທົ່າກັບຄ່າ primer Tm ຫຼື 2 ~ 4℃ ສູງກວ່າຄ່າ Tm.ການຂະຫຍາຍພັນໂດຍກົງ DNA polymerase ທີ່ໃຊ້ໃນຜະລິດຕະພັນນີ້ແມ່ນແຕກຕ່າງຈາກ Taq DNA polymerase ທໍາມະດາ, ແລະມີຄວາມຕ້ອງການພິເສດສໍາລັບອຸນຫະພູມ annealing ຕິກິຣິຍາ; ການນໍາໃຊ້ອຸນຫະພູມ annealing ສູງສາມາດຫຼຸດຜ່ອນການຂະຫຍາຍ nonspecific ປະສິດທິພາບແລະປັບປຸງປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍ.ສໍາລັບແມ່ແບບທີ່ຊັບຊ້ອນ, ການຂະຫຍາຍປະສິດທິພາບສາມາດບັນລຸໄດ້ໂດຍການປັບອຸນຫະພູມ annealing ແລະການຍືດເວລາການຂະຫຍາຍ.
ຄ.ຖ້າຄວາມຍາວຂອງຜະລິດຕະພັນຂະຫຍາຍແມ່ນ ≤1 kb, ເວລາຂະຫຍາຍແມ່ນຕັ້ງຢູ່ທີ່ 30 sec/kb;ຖ້າຄວາມຍາວຂອງຜະລິດຕະພັນຂະຫຍາຍໃຫຍ່ຂື້ນແມ່ນ > 1 kb, ເວລາຂະຫຍາຍແມ່ນຕັ້ງຢູ່ທີ່ 60 sec/kb.
ງ.ສໍາລັບຕົວຢ່າງທີ່ຊັບຊ້ອນຫຼືຕົວຢ່າງທີ່ມີຜົນຜະລິດ amplification ຕ່ໍາ, ຈໍານວນຮອບວຽນສາມາດເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງເຫມາະສົມເຖິງ 40 -50 ຮອບ.
ຄໍາຮ້ອງສະຫມັກ
ມັນໃຊ້ໄດ້ສໍາລັບການຂະຫຍາຍເນື້ອເຍື່ອພືດໂດຍກົງ ແລະການກວດຫາຕົວຢ່າງພືດທີ່ສົ່ງຜ່ານສູງທີ່ບໍ່ມີໂພລີຊາກຄາໄຣດ ແລະໂພລີຟີນອລ.
ບັນທຶກ
ສໍາລັບການນໍາໃຊ້ການຄົ້ນຄວ້າເທົ່ານັ້ນ.ບໍ່ແມ່ນເພື່ອໃຊ້ໃນຂັ້ນຕອນການວິນິດໄສ.
1. ສໍາລັບການຂະຫຍາຍພັນພືດ crude ຫຼື amplification ໂດຍກົງ, ແນະນໍາໃຫ້ໃຊ້ DNA genomic ບໍລິສຸດເປັນການຄວບຄຸມໃນທາງບວກກ່ອນທີ່ຈະເລີ່ມຕົ້ນການທົດລອງເພື່ອຮັບປະກັນວ່າລະບົບ, primers ແລະການດໍາເນີນງານທີ່ຖືກຕ້ອງ.
2. ການຂະຫຍາຍໂດຍກົງ DNA polymerase ທີ່ໃຊ້ໃນຊຸດນີ້ມີກິດຈະກໍາການອ່ານຫຼັກຖານທີ່ເຂັ້ມແຂງ.ຖ້າຕ້ອງປະຕິບັດການໂຄນ TA, ແນະນໍາໃຫ້ຊໍາລະ DNA ກ່ອນທີ່ຈະເພີ່ມ adenine.
3. ການແນະນຳການອອກແບບພື້ນຖານ:
ກ.ແນະນຳວ່າພື້ນຖານສຸດທ້າຍຢູ່ປາຍ 3′ ຂອງ primer ຄວນເປັນ G ຫຼື C.
ຂ.ຄວາມບໍ່ກົງກັນຕິດຕໍ່ກັນຄວນຫຼີກເວັ້ນໃນ 8 ຖານສຸດທ້າຍຢູ່ທີ່ 3′ ໃນຕອນທ້າຍຂອງ primer.ຄ.ຫຼີກເວັ້ນໂຄງສ້າງ hairpin ຢູ່ປາຍ 3′ ຂອງ primer.
ງ.ຄວາມແຕກຕ່າງຂອງຄ່າ Tm ຂອງ primer ຂ້າງຫນ້າແລະ primer ປີ້ນກັບກັນຄວນຈະບໍ່ເກີນ 1℃ ແລະຄ່າ Tm ຄວນຖືກປັບເປັນ 60 ~ 72 ℃ (Primer Premier 5 ແນະນໍາໃຫ້ຄິດໄລ່ຄ່າ Tm).
e.ລໍາດັບ primer ເພີ່ມເຕີມທີ່ບໍ່ກົງກັນກັບແມ່ແບບ, ບໍ່ຄວນຖືກລວມເຂົ້າໃນການຄິດໄລ່ຄ່າ primer Tm.
f.ແນະນໍາໃຫ້ມີເນື້ອໃນ GC ຂອງ primer ເປັນ 40% -60%.
g.ການແຜ່ກະຈາຍໂດຍລວມຂອງ A, G, C ແລະ T ໃນ primer ຄວນຈະເປັນໄປໄດ້.ຫຼີກເວັ້ນການນໍາໃຊ້ພາກພື້ນທີ່ມີເນື້ອໃນ GC ຫຼື AT ສູງ.
h.ຫຼີກເວັ້ນການປະກົດຕົວຂອງລໍາດັບເສີມຂອງ 5 ພື້ນຖານຫຼືຫຼາຍກວ່ານັ້ນພາຍໃນ primer ຫຼືລະຫວ່າງສອງ primers ແລະຫຼີກເວັ້ນການປະກົດຕົວຂອງລໍາດັບເສີມຂອງ 3 ຫຼືຫຼາຍກວ່າຖານຢູ່ປາຍ 3′ ຂອງສອງ primers.
i.ໃຊ້ຟັງຊັນ NCBI BLAST ເພື່ອກວດເບິ່ງຄວາມສະເພາະຂອງ primer ເພື່ອປ້ອງກັນການຂະຫຍາຍທີ່ບໍ່ສະເພາະ.
