mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Cap 2´ -O-methyltransferase ແມ່ນໄດ້ມາຈາກສາຍພັນ E. coli ທີ່ປະກອບພັນທຸກຳສຳລັບວັກຊີນ mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase.ເອນໄຊນີ້ເພີ່ມກຸ່ມ methyl ຢູ່ທີ່ຕໍາແຫນ່ງ 2'-O ຂອງ nucleotide ທໍາອິດທີ່ຕິດກັບໂຄງສ້າງ cap ຢູ່ທີ່ 5'end ຂອງ RNA. enzyme ໃຊ້ S-adenosylmethionine (SAM) ເປັນຜູ້ໃຫ້ methyl ກັບ methylate capped RNA (cap -0) ສົ່ງຜົນໃຫ້ມີໂຄງສ້າງ cap- 1.

ໂຄງສ້າງ Cap1 ສາມາດເພີ່ມປະສິດທິພາບການແປໄດ້, ປັບປຸງການສະແດງອອກຂອງ mRNA ໃນ transfection ແລະ microinjection ການທົດລອງ. enzyme ໂດຍສະເພາະຕ້ອງການ RNA ທີ່ມີຫມວກ m7GpppN ເປັນ substrate.ມັນບໍ່ສາມາດໃຊ້ RNA ກັບ pN, ppN, pppN ຫຼື GpppN ໃນຕອນທ້າຍ 5'.Capped RNA ອາດຈະຖືກກະກຽມຜ່ານການຖອດຂໍ້ຄວາມໃນ vitro ໂດຍໃຊ້ cap analog ຫຼືຜ່ານ enzymatic capping ໂດຍໃຊ້ Vaccinia Capping Enzyme.

ອົງປະກອບ

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)

10× Capping ປະຕິກິລິຍາ Buffer

ການເກັບຮັກສາ

-25 ～-15 ℃​ສໍາ​ລັບ​ການ​ເກັບ​ຮັກ​ສາ (ຫຼີກ​ລ້ຽງ​ການ​ເປັນ​ຊ​້​ໍາ freeze​-thaw cycles​)

ພື້ນທີ່ເກັບຂໍ້ມູນ

20 mM Tris-HCl (pH 8.0,25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glycerol.

ນິຍາມຫົວໜ່ວຍ

ຫນຶ່ງຫນ່ວຍແມ່ນຖືກກໍານົດເປັນຈໍານວນ enzyme ທີ່ຕ້ອງການເພື່ອ methylate 10 pmoles ຂອງ 80 nt capped RNA transcript ໃນ 1 ຊົ່ວໂມງທີ່ 37 ° C.

ການ​ທົດ​ສອບ​ການ​ຄວບ​ຄຸມ​ຄຸນ​ນະ​ພາບ​

Exonuclease: 50U ຂອງ mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ກັບ 1μg λ-Hind III ຍ່ອຍ DNA ທີ່ 37 ℃ສໍາລັບ 16 ຊົ່ວໂມງໃຫ້ຜົນຜະລິດບໍ່ມີການເຊື່ອມໂຊມຕາມທີ່ກໍານົດໂດຍ agarose gel electrophoresis.

Endonuclease: 50 U ຂອງ mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ກັບ 1 μg λDNA ທີ່ 37 ℃ ເປັນເວລາ 16 ຊົ່ວໂມງໃຫ້ຜົນຜະລິດບໍ່ມີການເຊື່ອມໂຊມຕາມທີ່ກໍານົດໂດຍ agarose gel electrophoresis.

Nickase: 50U ຂອງ mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ກັບ 1μg pBR322 ຢູ່ທີ່ 37 ℃ສໍາລັບ 16 ຊົ່ວໂມງຜົນຜະລິດບໍ່ມີການເຊື່ອມໂຊມຕາມທີ່ກໍານົດໂດຍ agarose gel electrophoresis.

RNase: 50U ຂອງ mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ກັບ 1.6μg MS2 RNA ສໍາລັບ 4 ຊົ່ວໂມງທີ່ 37 ℃ yields ບໍ່ມີການເຊື່ອມໂຊມຕາມການກໍານົດໂດຍ agarose gel electrophoresis.

E. coli DNA: 50U ຂອງ mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ຖືກກວດຫາການປະກົດຕົວຂອງE. coli DNA genomic ໂດຍໃຊ້ TaqMan qPCR ກັບ primers ສະເພາະສໍາລັບE. coli 16S rRNA locus.ໄດ້E. coli ການປົນເປື້ອນ DNA ພັນທຸ ກຳ ແມ່ນ =1E. coli genome.

ເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ Endotoxin: LAL-test, ອີງຕາມການຈີນ Pharmacopoeia IV 2020 edition, gel limit test method, general rule (1143).ເນື້ອໃນ endotoxin ເຊື້ອແບັກທີເຣັຍຄວນຈະເປັນ = 10 EU/mg.

ລະບົບປະຕິກິລິຍາແລະເງື່ອນໄຂ

1. ສົມທົບປະລິມານທີ່ເຫມາະສົມຂອງ Capped RNA ແລະ H2O ທີ່ບໍ່ມີ RNase ໃນທໍ່ microfuge 1.5 mL ເຂົ້າໄປໃນປະລິມານສຸດທ້າຍຂອງ 16.0 µL.

2. ອຸ່ນທີ່ 65 ℃ ເປັນເວລາ 5 ນາທີ ຕິດຕາມດ້ວຍນ້ຳກ້ອນ 5 ນາທີ.

3. ເພີ່ມອົງປະກອບຕໍ່ໄປນີ້ຕາມລໍາດັບທີ່ລະບຸໄວ້ (ສໍາລັບ methylation ຂອງ Capped RNA

ໜ້ອຍກວ່າ 10

*10× Capping Reaction Buffer : 500 mM Tris-HCl(pH 8.0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT.

4. ອົບທີ່ອຸນຫະພູມ 37 ℃ ເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງ (2 ຊົ່ວໂມງຂອງ incubation ແມ່ນແນະນໍາໃຫ້ fragment ເປົ້າຫມາຍຫນ້ອຍກ່ວາ 200 nt).

ຄໍາຮ້ອງສະຫມັກ

ເພື່ອປັບປຸງການສະແດງອອກຂອງ mRNA ໃນລະຫວ່າງການທົດລອງ microinjection ແລະ transfection.

ຫມາຍເຫດກ່ຽວກັບການນໍາໃຊ້

1. ກ່ອນທີ່ຈະຕິກິຣິຍາ, RNA ຄວນໄດ້ຮັບການບໍລິສຸດແລະລະລາຍໃນນ້ໍາທີ່ບໍ່ມີນິວເຄລຍ, ການແກ້ໄຂທັງຫມົດບໍ່ຄວນມີ EDTA ແລະ ions.

2. ແນະນໍາໃຫ້ເຮັດຄວາມຮ້ອນຂອງ RNA ຕົວຢ່າງຢູ່ທີ່ 65 ℃ສໍາລັບ 5 ນາທີກ່ອນທີ່ຈະຕິກິຣິຍາທີ່ຈະເອົາໂຄງສ້າງຮອງຢູ່ໃນ 5'ໃນຕອນທ້າຍຂອງການຖອດຂໍ້ຄວາມ.ມັນ​ສາ​ມາດ​ໄດ້​ຮັບ​ການ​ຂະ​ຫຍາຍ​ເປັນ 10 ນາ​ທີ​ສໍາ​ລັບ​ໂຄງ​ປະ​ກອບ​ການ 5 ´ -terminal ສະ​ລັບ​ສັບ​ຊ້ອນ​.