ໂປຣ
ຜະລິດຕະພັນ
Hi-yield T7 in vitro transcription reagent (Thermostable) HCP0036A ຮູບພາບເດັ່ນ
  • Hi-yield T7 in vitro transcription reagent (Thermostable) HCP0036A

Hi-yield T7 in vitro reagent transcription (ເຮັດຄວາມຮ້ອນໄດ້)


ໝາຍເລກແມວ:HCP0036A

ການຫຸ້ມຫໍ່: 50T

ຊຸດເຄື່ອງປະຕິການຖອດຂໍ້ຄວາມໃນ vitro Hi-yield T7 (Thermostable) ແມ່ນສາມາດຖອດຂໍ້ຄວາມໃນ vitro ໃນອຸນຫະພູມທີ່ສູງກວ່າເຖິງ 50°C.

ລາຍ​ລະ​ອຽດ​ຜະ​ລິດ​ຕະ​ພັນ

ຂໍ້ມູນຜະລິດຕະພັນ

ຊຸດເຄື່ອງປະຕິການຖອດຂໍ້ຄວາມໃນ vitro Hi-yield T7 (Thermostable) ແມ່ນສາມາດຖອດຂໍ້ຄວາມໃນ vitro ໃນອຸນຫະພູມທີ່ສູງກວ່າເຖິງ 50°C.ຊຸດດັ່ງກ່າວສາມາດສັງເຄາະຂໍ້ຄວາມ RNA ທີ່ໄດ້ຮັບຜົນຜະລິດສູງໂດຍໃຊ້ DNA ເສັ້ນຄູ່ທີ່ມີສາຍພັນ T7 ເປັນແມ່ແບບແລະ NTPs ເປັນຊັ້ນຍ່ອຍ.ຊຸດດັ່ງກ່າວແມ່ນເຫມາະສົມສໍາລັບການລວມເອົາ nucleotides ທີ່ຖືກດັດແປງເພື່ອໃຫ້ໄດ້ biotin ທີ່ຕິດສະຫຼາກ, ຍ້ອມສີແລະຕິດສະຫຼາກ RNA.ຊຸດດັ່ງກ່າວຍັງສາມາດຖືກ ນຳ ໃຊ້ເຂົ້າໃນການສັງເຄາະຂອງ co-transcriptionally capping mRNAs ດ້ວຍ cap analogs.ຊຸດບັນຈຸມີ nucleotides ດັດແກ້ N1-Me-pUTP ເປັນທາງເລືອກ.

ແຕ່ລະປະຕິກິລິຍາມາດຕະຖານໃຫ້ຜົນຜະລິດເຖິງ 150-200 μgຂອງ RNA ຈາກແມ່ແບບ DNA 1μg.ຂະໜາດຂອງປະຕິກິລິຍາສາມາດຂະຫຍາຍໄດ້ເຖິງຜົນຜະລິດ RNA ລະດັບ milligram ຕາມຄວາມຕ້ອງການ.

RNA ສັງເຄາະຈາກຊຸດແມ່ນເຫມາະສົມສໍາລັບຄໍາຮ້ອງສະຫມັກຈໍານວນຫຼາຍລວມທັງການສຶກສາໂຄງສ້າງ RNA ແລະຫນ້າທີ່, ຊີວະເຄມີ ribozyme, ການວິເຄາະປ້ອງກັນ RNase ແລະ blots ປະສົມໂດຍອີງໃສ່, ຕ້ານຄວາມຮູ້ສຶກ RNA ແລະການທົດລອງ RNAi.RNA ສັງເຄາະຈາກຊຸດຍັງເຫມາະສົມສໍາລັບການຜະລິດ enzymatic ຂອງ RNA capped ໂດຍ vaccinia capping enzyme ແລະ 2'-O-Methyltransferase ແລະຖືກ tailed ກັບ Poly(A) polymerase ເພື່ອປັບປຸງຄວາມຫມັ້ນຄົງແລະຄວາມສາມາດໃນການແປຂອງ RNA ທີ່ໃຊ້ສໍາລັບການແປພາສາ vitro. , transfection, ແລະ microinjection.


  • ທີ່ຜ່ານມາ:
  • ຕໍ່ໄປ:

  • ອົງປະກອບ

    ອົງປະກອບ

    ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ

    ປະລິມານ

    ATP

    100 ມມ

    100 ມລ

    CTP

    100 ມມ

    100 ມລ

    GTP

    100 ມມ

    100 ມລ

    UTP

    100 ມມ

    100 ມລ

    N1-Me-pUTP

    100 ມມ

    100 ມລ

    10 × Hi-Yield IVT Buffer A

    /

    100 ມລ

    ທາດປະສົມຂອງເອນໄຊ (ສາມາດລະບາຍຄວາມຮ້ອນໄດ້)

    /

    100 ມລ

     

    ເງື່ອນໄຂການເກັບຮັກສາ

    ການຂົນສົ່ງພາຍໃຕ້ 0 ° C ແລະການເກັບຮັກສາຢູ່ທີ່ -25 ~ 15 ° C.

     

    ພິທີການ

    •ການກະກຽມແມ່ແບບ DNA

    Linearized plasmid DNA, ຜະລິດຕະພັນ PCR ຫຼື oligonucleotides DNA ສັງເຄາະສາມາດໃຊ້ເປັນແມ່ແບບສໍາລັບການຖອດຂໍ້ຄວາມໃນ vitro ກັບຊຸດຊຸດ. ເທມເພດ DNA ສາມາດຖືກລະລາຍໃນ TE buffer ຫຼື RNase-free ddH2O.

    Plasmid ແມ່ແບບ: plasmid ທີ່ມີເສັ້ນຊື່ຕ້ອງມີພາກພື້ນສົ່ງເສີມ T7 ເປັນແມ່ແບບ DNA.ຄຸນນະພາບຂອງ plasmid linearized ມີຜົນກະທົບຕໍ່ຜົນຜະລິດແລະຄວາມສົມບູນຂອງ RNA.ແມ່ແບບ plasmid ທີ່ມີເສັ້ນຊື່ຢ່າງສົມບູນຂອງຄວາມບໍລິສຸດທີ່ສູງທີ່ສຸດແມ່ນສໍາຄັນສໍາລັບການນໍາໃຊ້ຢ່າງສໍາເລັດຜົນຂອງຊຸດເພາະວ່າ plasmid ວົງບໍ່ໄດ້ຖືກຢຸດເຊົາຢ່າງມີປະສິດທິພາບ.ຜົນຜະລິດການຖອດຂໍ້ຄວາມສູງສຸດແມ່ນບັນລຸໄດ້ດ້ວຍແມ່ແບບທີ່ມີຄວາມບໍລິສຸດສູງສຸດ.ເພື່ອຜະລິດ RNA transcript ຂອງຄວາມຍາວທີ່ກໍານົດໄວ້, plasmid DNA ຕ້ອງໄດ້ຮັບການ linearized ຢ່າງສົມບູນດ້ວຍ enzyme ຂໍ້ຈໍາກັດທີ່ສ້າງປາຍ blunt ຫຼື 5'-overhangs.plasmid linearized purified ໂດຍວິທີການຫ້ອງທົດລອງສາມາດບໍ່ມີການປົນເປື້ອນ RNase, ທາດໂປຼຕີນ, RNA ແລະເກືອ.

     ແມ່ແບບ PCR: ຜະລິດຕະພັນ PCR ທີ່ບັນຈຸຕົວສົ່ງເສີມ T7 RNA polymerase ໃນທິດທາງທີ່ຖືກຕ້ອງສາມາດຖອດຂໍ້ຄວາມໄດ້.ຜົນຜະລິດທີ່ດີກວ່າຈະໄດ້ຮັບດ້ວຍຜະລິດຕະພັນ PCR ທີ່ບໍລິສຸດ, ເຖິງແມ່ນວ່າການປະສົມ PCR ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ໂດຍກົງ.

    •ສັງເຄາະ DNA ໂອລິກອນUcleotides:ສັງເຄາະ DNA oligonucleotides ເຊິ່ງມີທັງສາຍຄູ່ ຫຼື ສ່ວນຫຼາຍແມ່ນສາຍດ່ຽວທີ່ມີລຳດັບຕົວສົ່ງເສີມ T7 ສາຍສອງສາມາດຖອດຂໍ້ຄວາມໄດ້.

    ອະນຸສັນຍາການສັງເຄາະ RNA

    ການໃສ່ຖົງມືແລະການນໍາໃຊ້ທໍ່ທີ່ບໍ່ມີນິວເຄລຍແລະທາດ reagents ເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການປົນເປື້ອນ RNase ແມ່ນແນະນໍາຢ່າງແຂງແຮງ.ປະຕິກິລິຍາຂອງປະລິມານໜ້ອຍຄວນຖືກປະກອບໃສ່ໃນທໍ່ microfuge ທີ່ບໍ່ມີນິວເຄລຍ ຫຼືທໍ່ເສັ້ນດ່າງ PCR.

    ການສັງເຄາະ RNA ທຳມະດາ

    1.Thaw ອົງປະກອບຂອງຊຸດທີ່ຈໍາເປັນ, ປະສົມແລະກໍາມະຈອນ-spin ໃນ microfuge ເພື່ອເກັບກໍາການແກ້ໄຂກັບລຸ່ມຂອງທໍ່.ຮັກສາຢູ່ເທິງກ້ອນ.

    2. ຖ້າຫາກວ່າທ່ານກໍາລັງວາງແຜນທີ່ຈະດໍາເນີນການປະຕິກິລິຍາຫຼາຍ, ມັນເປັນການສະດວກໃນການກະກຽມການປະສົມຕົ້ນສະບັບໂດຍການສົມທົບປະລິມານເທົ່າທຽມກັນຂອງ 10× Hi-Yield IVT Buffer ແລະສີ່ ribonucleotide (NTP) ວິທີແກ້ໄຂ.ໃຊ້ປະສົມແມ່ບົດ 10 µl ຕໍ່ປະຕິກິລິຍາ.

    3. ປະ​ກອບ​ຕິ​ກິ​ຣິ​ຍາ​ທີ່​ອຸນ​ຫະ​ພູມ​ຫ້ອງ​ໃນ​ຄໍາ​ສັ່ງ​ດັ່ງ​ຕໍ່​ໄປ​ນີ້​:

    Reagent

    ຈໍາ​ນວນ

    ນ້ໍາທີ່ບໍ່ມີນິວເຄລຍ

    X μL

    10 × Hi-Yield IVT Buffer A

    2 ມລ

    ATP/CTP/GTP/UTP *(100 mM ແຕ່ລະອັນ)

    2 μLແຕ່ລະຄົນ (10 mM ແຕ່ລະຄັ້ງສຸດທ້າຍ)

    ແມ່ແບບ DNA

    Y μL (1 μg)

    ທາດປະສົມຂອງເອນໄຊ (ສາມາດລະບາຍຄວາມຮ້ອນໄດ້)

    2 ມລ

    ປະລິມານປະຕິກິລິຍາທັງໝົດ

    20 ມລ

    * ເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນພູມຕ້ານທານຂອງຜະລິດຕະພັນ, UTP ສາມາດຖືກແທນທີ່ດ້ວຍ N1-Me-pUTP ໃນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສຸດທ້າຍດຽວກັນ.

    4. ປະສົມຢ່າງລະອຽດ, ປັ່ນກໍາມະຈອນໃນ microfuge.ອົບຢູ່ທີ່ 37 ອົງສາເຊ ເປັນເວລາ 2 ຊົ່ວໂມງ, ຫຼື 50 ອົງສາເຊ ເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງ ຖ້າຕ້ອງການປະຕິກິລິຍາອຸນຫະພູມສູງ.

    5. ການຍ່ອຍສະຫຼາຍຂອງ DNA: ເພື່ອເອົາ DNA ຂອງແມ່ແບບ, ເພີ່ມ 10U ຂອງ DNase I ໃສ່ແຕ່ລະປະຕິກິລິຍາ 20 μL, ປົນກັນແລະອົບຢູ່ທີ່ 37 ℃ສໍາລັບ 30 ນາທີ.

     

    ການສັງເຄາະ RNA ສູງສຸດ

    ອະນຸສັນຍາທີ່ຄ້າຍຄືກັນກັບການສັງເຄາະ RNA ທໍາມະດາ, ຍົກເວັ້ນຂັ້ນຕອນຂອງການປະກອບປະຕິກິລິຍາ.ປະ​ກອບ​ຕິ​ກິ​ຣິ​ຍາ​ຂອງ​ການ​ສັງ​ເຄາະ RNA capped ໃນ​ອຸນ​ຫະ​ພູມ​ຫ້ອງ​ໃນ​ຄໍາ​ສັ່ງ​ດັ່ງ​ຕໍ່​ໄປ​ນີ້​:

    Reagent

    ຈໍາ​ນວນ

    ນ້ໍາທີ່ບໍ່ມີນິວເຄລຍ

    X μL

    10 × Hi-Yield IVT Buffer A

    2 ມລ

    ATP/CTP/GTP/UTP *(100 mM ແຕ່ລະອັນ)

    2 μLແຕ່ລະຄົນ (10 mM ແຕ່ລະຄັ້ງສຸດທ້າຍ)

    ອະນາລັອກ Cap (100 mM)

    1.6 ມລ

    ແມ່ແບບ DNA

    Y μL (1 μg)

    ທາດປະສົມຂອງເອນໄຊ (ສາມາດລະບາຍຄວາມຮ້ອນໄດ້)

    2 ມລ

    ປະລິມານປະຕິກິລິຍາທັງໝົດ

    20 ມລ

    *** ຖ້າຕ້ອງການ, Cap1(3'OH AG) ແລະ cap1(3'OME AG) ສາມາດໃຊ້ ascap analogs.ຂໍແນະນຳເຄື່ອງປະຕິການຖອດຂໍ້ຄວາມຮ່ວມກັນຂອງພວກເຮົາ Co-capping T7 invitro reagent (pUTP, CAP GAG (3'OMe), pUTP, CAP GAG, N1-Me- pUTP, CAP GAG (3'OMe) ແລະ N1-Me-pUTP, CAP GAG.

     

    ການຊໍາລະລ້າງ mRNA

    • ຟີນອລ: chloroform ພິເສດປະຕິບັດ ແລະເອທານອນ ຝົນ

    ສໍາລັບການໂຍກຍ້າຍຂອງທາດໂປຼຕີນແລະສ່ວນໃຫຍ່ຂອງ nucleotides ຟຣີ, phenol: ການສະກັດເອົາ chloroform ແລະການ precipitation ethanol ຂອງ RNA transcripts ແມ່ນວິທີການທີ່ຕ້ອງການ.

    1.ປັບປະລິມານຕິກິຣິຍາເປັນ 180 μLby ເພີ່ມນ້ໍາ 160 μL nuclease-free.ຕື່ມ 20 μLຂອງ 3M sodium acetate, pH5.2, ປະສົມຢ່າງລະອຽດ.

    2. ສະກັດດ້ວຍປະລິມານທີ່ເທົ່າທຽມກັນຂອງສ່ວນປະສົມຂອງ phenol/chloroform 1:1, centrifuge ທີ່ 10000 rpm ເປັນເວລາ 5 ນາທີ.ລວບລວມໄລຍະທີ່ມີນ້ໍາແລະໂອນໄປຫາທໍ່ໃຫມ່.

    3. ປະຕິບັດຕາມດ້ວຍການສະກັດສອງທີ່ມີປະລິມານເທົ່າທຽມກັນຂອງ chloroform.ລວບລວມໄລຍະທີ່ມີນ້ໍາແລະໂອນໄປຫາທໍ່ໃຫມ່.

    4. RNA ໄດ້ຖືກ precipitated ດ້ວຍ 2 ປະລິມານຂອງເອທານອນ.ອົບຢູ່ທີ່ -20 ℃ຢ່າງຫນ້ອຍ 30 ນາທີ, ແລະເກັບ pallet ໂດຍ centrifugation ສໍາລັບ 15 ນາທີ.ເອົາ supernatant ອອກຢ່າງລະມັດລະວັງ.

    5. ລ້າງພາເລດດ້ວຍ 150 μL ~ 200 μL ເຢັນ 70% ethanol.

    6. ເອົາຜ້າແພເຊັດໃຫ້ແຫ້ງເປັນເວລາ 2 ນາທີ ແລະ ຢຸດຄືນໃນນ້ຳ 100 μL ~ 200 μL RNase-free ຫຼື buffers ອື່ນໆ.

     

    • ຝົນ LiCl

    LiCl precipitation ຂອງ RNA ມີປະສິດທິພາບໃນການກໍາຈັດສ່ວນໃຫຍ່ຂອງ NTPs ແລະ enzymes ທີ່ບໍ່ໄດ້ລວມຕົວ.

    1. ເພີ່ມປະລິມານທີ່ເທົ່າທຽມກັນຂອງການແກ້ໄຂ LiCl (5M), ປົນກັນ.

    2. ອົບຢູ່ -20 ℃ ຢ່າງຫນ້ອຍ 30 ນາທີ.Centrifuge ທີ່ 4℃ ທີ່ 12000 rpm ສໍາລັບ 15 ນາທີເພື່ອ pallet RNA.ເອົາ supernatant ອອກຢ່າງລະມັດລະວັງ.

    3. ຢາງພາລາໂດຍການເພີ່ມ 200 μLຂອງ precooling 70% ethanol.ເອົາເອທານອນອອກຢ່າງລະມັດລະວັງ.ເຮັດຊ້ໍາຂັ້ນຕອນສໍາລັບ 2-3 ເທື່ອ.

    4. ເອົາຜ້າແພໃຫ້ແຫ້ງປະມານ 5~10 ນາທີ ແລະ ຢຸດຄືນໃນນ້ຳທີ່ບໍ່ມີ RNase 100 μL ~ 200 μL ຫຼື buffers ອື່ນໆ.

    • ໝຸນ ການຊໍາລະລ້າງຖັນ

    ຖັນ spin ຈະເອົາ NTPs, ທາດໂປຼຕີນ ແລະເກືອທີ່ບໍ່ໄດ້ລວມເຂົ້າກັນອອກ.

    • puri ລູກປັດແມ່ເຫຼັກນິຍາຍ

    ການເຮັດຄວາມສະອາດລູກປັດແມ່ເຫຼັກສາມາດເອົາ nucleotides, ທາດໂປຼຕີນແລະເກືອທີ່ບໍ່ໄດ້ລວມເຂົ້າກັນ.

     

    ປະລິມານຂອງຜະລິດຕະພັນຕິກິຣິຍາ

    • ປະລິມານໂດຍ UV ການດູດຊຶມແສງສະຫວ່າງ: ຜະລິດຕະພັນປະຕິກິລິຢາຕ້ອງການການຊໍາລະລ້າງເພາະວ່າ nucleotides ໃດໆທີ່ບໍ່ລວມຕົວແລະ DNA ແມ່ແບບໃນສ່ວນປະສົມຂອງປະຕິກິລິຍາຈະມີຜົນກະທົບຕໍ່ການອ່ານ.ການວັດແທກ spectrophotometry UV ຢູ່ 260 nm ສາມາດໄດ້ຮັບຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ RNA ໄດ້ຢ່າງງ່າຍດາຍ.ສໍາລັບ RNA ເສັ້ນດ່ຽວ, 1 A260 ເທົ່າກັບ RNA ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ 40 μg/mL.

     ປະລິມານ by ສີຍ້ອມ: ປະລິມານຂອງຜະລິດຕະພັນຕິກິຣິຍາສາມາດນໍາໃຊ້ກັບສີຍ້ອມ Ribogreen ໂດຍບໍ່ມີການ purification ເພາະວ່າ nucleotides ທີ່ບໍ່ປະສົມປະສານຈະບໍ່ມີຜົນກະທົບຕໍ່ການປະເມີນຜົນຂອງຜະລິດຕະພັນ RNA.

      

    ບັນທຶກ

    • ປະຕິກິລິຍາການຖອດຂໍ້ຄວາມຄວນຖືກປະຕິບັດໃນສະພາບແວດລ້ອມທີ່ບໍ່ມີ RNase.ຄວນໃສ່ຖົງມື.ຄໍາແນະນໍາ, ທໍ່ແລະນ້ໍາຄວນຈະບໍ່ມີນິວເຄລຍ.

    •ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສຸດທ້າຍຂອງ NTPs ທີ່ດີທີ່ສຸດທັງຫມົດແມ່ນ 10 mM, ແລະທ່ານສາມາດປ່ຽນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສຸດທ້າຍຂອງ NTPs ຕາມສະພາບຕົວຈິງ.

    • ການປະສົມປະຕິກິລິຍາສັງເຄາະ RNA ຄວນຖືກກະກຽມຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ, ເພາະວ່າ DNA ອາດຈະຕົກຢູ່ໃນສະພາບຂອງ spermidine ຢູ່ທີ່ 4 ° C.

    • ຜົນຜະລິດຂອງການຖອດຂໍ້ຄວາມທີ່ມີຄວາມຍາວທີ່ເຫມາະສົມຈະຫຼຸດລົງຖ້າ DNA ຂອງແມ່ແບບແມ່ນ linearized ບໍ່ສົມບູນ.

    • ການປະສົມປະຕິກິລິຍາສາມາດປັບຂະໜາດຂຶ້ນ ຫຼື ລົງໄດ້.

    • ປະສົມສານກັນບູດຈົນກ່ວາສານທີ່ບໍ່ລະລາຍຈະລະລາຍໝົດກ່ອນນຳໃຊ້, ຖ້າພົບກັນວ່າມີສານທີ່ບໍ່ລະລາຍພາຍຫຼັງການລະລາຍ.

    • ສໍາລັບປະຕິກິລິຍາກັບ transcripts ສັ້ນກວ່າ 300 bp, incubation 4-8 h ທີ່ 37 ℃ ຄວນໃຫ້ຜົນຜະລິດສູງກວ່າ.

    • ແມ່ແບບ DNA ທີ່ໃຊ້ສໍາລັບການຖອດຂໍ້ຄວາມການສັງເຄາະ RNA ມາດຕະຖານຄວນມີລໍາດັບການສົ່ງເສີມ T7 ຕິດຕາມດ້ວຍລໍາດັບການລິເລີ່ມ GGG, ເພາະວ່າ T7 RNA polymerase ມີຄວາມໃກ້ຊິດຂອງ GTP ສູງກວ່າ.

    • ແມ່ແບບ DNA ທີ່ໃຊ້ສໍາລັບການສັງເຄາະ mRNA ກັບລະບົບການຖອດຂໍ້ຄວາມຮ່ວມກັນຄວນມີລໍາດັບການສົ່ງເສີມ T7 ຕິດຕາມດ້ວຍລໍາດັບການລິເລີ່ມ AGG.

    ການແກ້ໄຂບັນຫາ

    a) ຜົນຜະລິດຕ່ໍາຂອງເຕັມເລນgth RNA:

    ຖ້າປະຕິກິລິຍາການຖອດຂໍ້ຄວາມສ້າງ RNA ທີ່ມີຄວາມຍາວເຕັມ, ແຕ່ຜົນຜະລິດຕ່ໍາກວ່າທີ່ຄາດໄວ້ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ, ມັນເປັນໄປໄດ້ວ່າສິ່ງປົນເປື້ອນໃນແມ່ແບບ DNA ກໍາລັງຂັດຂວາງ RNA polymerase, ຫຼືຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ DNA ອາດຈະຕໍ່າເກີນໄປຫຼືບໍ່ຖືກຕ້ອງ.

    ຄຳແນະນຳ: ການເຮັດຄວາມສະອາດເພີ່ມເຕີມຂອງແມ່ແບບ DNA ແມ່ນແນະນໍາໃຫ້.

     

    b) RNA ບົດບັນທຶກ smearing ສຸດ ແດນຍ່ຽວ ເຈນ:

    ຖ້າ RNA ປະກົດວ່າຊຸດໂຊມໃນ denaturing agarose ຫຼື polyacrylamide gel, ແບບ DNA ຫຼືຂະບວນການທົດລອງຈະຖືກປົນເປື້ອນດ້ວຍ RNase.

    ຄຳແນະນຳ: ຖ້າແມ່ແບບ DNA plasmid ປົນເປື້ອນດ້ວຍ RNase, ດໍາເນີນການສະກັດເອົາ phenol / chloroform ແລະ ethanol precipitate.ໃຫ້ແນ່ໃຈວ່າຄໍາແນະນໍາແລະທໍ່ທີ່ໃຊ້ໃນລະຫວ່າງການທົດລອງແມ່ນບໍ່ມີ RNase.ກະລຸນາໃສ່ເສື້ອຄຸມຫ້ອງທົດລອງ, ໜ້າກາກ ແລະຖົງມືທີ່ໃຊ້ແລ້ວຖິ້ມໄດ້.

     

    c) RNA ບົດບັນທຶກຂອງ ຂະໜາດໃຫຍ່ກວ່າທີ່ຄາດໄວ້:

    ຖ້າ RNA transcript ປາກົດຂະຫນາດໃຫຍ່ກວ່າທີ່ຄາດໄວ້ຢູ່ໃນ gel denaturing, template plasmid DNA ອາດຈະຖືກຍ່ອຍສະຫຼາຍບໍ່ຄົບຖ້ວນ.ການປະກົດຕົວຂອງໂຄງສ້າງຂັ້ນສອງທີ່ແຂງແຮງສາມາດເຮັດໃຫ້ RNA transcript ບໍ່ເປັນ denatured ຢ່າງສົມບູນ.

    ຄໍາແນະນໍາ: ກວດເບິ່ງແມ່ແບບສໍາລັບການຍ່ອຍອາຫານທີ່ສົມບູນ, ຖ້າ plasmid ບໍ່ໄດ້ຍ່ອຍໄດ້ຖືກຢືນຢັນ, ຊໍ້າຄືນການຍ່ອຍອາຫານຂອງເອນໄຊທີ່ຈໍາກັດ.ຫຼຸດຜ່ອນໂຄງສ້າງຂັ້ນສອງຂອງແມ່ແບບ DNA ໃນຂັ້ນຕອນຂອງການອອກແບບລໍາດັບ.

     

    d) RNA ບົດບັນທຶກ ຂອງ ນ້ອຍກວ່າ ຂະໜາດ ກວ່າ ຄາດວ່າຈະ:

    ຖ້າການວິເຄາະ denaturing gel ສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງການມີແຖບຂະຫນາດນ້ອຍກວ່າຂະຫນາດທີ່ຄາດໄວ້, ສ່ວນຫຼາຍແມ່ນຍ້ອນໂພລີເມີເຣສສິ້ນສຸດລົງກ່ອນໄວອັນຄວນ.ບາງລໍາດັບທີ່ຄ້າຍຄືກັບສັນຍານການຢຸດເຊົາ T7 RNA polymerase ຈະເຮັດໃຫ້ເກີດການຢຸດເຊົາກ່ອນໄວອັນຄວນ.

    ຄຳແນະນຳ: ການອົບປະຕິກິລິຍາການຖອດຂໍ້ຄວາມໃນອຸນຫະພູມຕ່ຳ, ຕົວຢ່າງຢູ່ທີ່ 30°C, ອາດຈະເພີ່ມອັດຕາສ່ວນຂອງການຖອດຂໍ້ຄວາມທີ່ມີຄວາມຍາວເຕັມ, ແນວໃດກໍ່ຕາມຜົນຜະລິດຈະຫຼຸດລົງ.ສໍາລັບແມ່ແບບທີ່ອຸດົມສົມບູນ GC, ຫຼືແມ່ແບບທີ່ມີໂຄງສ້າງຮອງ, ການ incubation ຢູ່ທີ່ 42 ° C ອາດຈະປັບປຸງຜົນຜະລິດຂອງການຖອດຂໍ້ຄວາມເຕັມຄວາມຍາວ.

    ຜະ​ລິດ​ຕະ​ພັນ​ທີ່​ກ່ຽວ​ຂ້ອງ

    ຂຽນຂໍ້ຄວາມຂອງທ່ານທີ່ນີ້ແລະສົ່ງໃຫ້ພວກເຮົາ