RNA ສອງສາຍ (dsRNA) ELISA KIT

ຊຸດນີ້ແມ່ນການຈັບຄູ່ Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ກັບລະບົບ biotin-Streptavidin, ສໍາລັບການວັດແທກປະລິມານຂອງ dsRNA ທີ່ມີຄວາມຍາວເກີນ 60 ຄູ່ຖານ (bp), ບໍ່ວ່າຈະເປັນລໍາດັບ.ແຜ່ນໄດ້ຖືກເຄືອບກ່ອນດ້ວຍ anti-dsRNA antibody.dsRNA ທີ່ມີຢູ່ໃນຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກເພີ່ມແລະຜູກມັດກັບພູມຕ້ານທານທີ່ເຄືອບຢູ່ເທິງນໍ້າສ້າງ.ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນ, ພູມຕ້ານທານຕ້ານ dsRNA biotinylated ຖືກເພີ່ມແລະຜູກມັດກັບ dsRNA ໃນຕົວຢ່າງ.ຫຼັງຈາກລ້າງ, HRP-Streptavidin ຈະຖືກເພີ່ມແລະຜູກມັດກັບພູມຕ້ານທານ Biotinylated anti-dsRNA.ຫຼັງຈາກ incubation unbound HRP-Streptavidin ໄດ້ຖືກລ້າງອອກ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ການແກ້ໄຂ TMB substrate ໄດ້ຖືກເພີ່ມແລະ catalyzed ໂດຍ HRP ເພື່ອຜະລິດຜະລິດຕະພັນສີຟ້າທີ່ປ່ຽນເປັນສີເຫຼືອງຫຼັງຈາກເພີ່ມການແກ້ໄຂການຢຸດເຊົາການເປັນກົດ.ຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງສີເຫຼືອງແມ່ນອັດຕາສ່ວນກັບຈໍານວນເປົ້າຫມາຍຂອງ dsRNA ທີ່ຖືກຈັບຢູ່ໃນແຜ່ນ.ການດູດຊຶມແມ່ນວັດແທກຢູ່ທີ່ 450 nm.

ຄໍາຮ້ອງສະຫມັກ

ຊຸດນີ້ແມ່ນສໍາລັບການວັດແທກປະລິມານຂອງ dsRNA ທີ່ຕົກຄ້າງ.

ອົງປະກອບຊຸດ

ການເກັບຮັກສາແລະຄວາມຫມັ້ນຄົງ

1. ສໍາລັບຊຸດທີ່ບໍ່ໄດ້ໃຊ້: ຊຸດທັງຫມົດສາມາດຖືກເກັບໄວ້ຢູ່ທີ່ 2 ~ 8 ℃ໃນຊີວິດ shelf.ແສງສະຫວ່າງທີ່ເຂັ້ມແຂງຄວນໄດ້ຮັບການຫຼີກເວັ້ນເພື່ອຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງການເກັບຮັກສາ.

2. ສໍາລັບຊຸດທີ່ໃຊ້ແລ້ວ: ເມື່ອເປີດ microplate, ກະລຸນາປົກປິດຝາອັດປາກຂຸມທີ່ບໍ່ໄດ້ໃຊ້ແລ້ວກັບໃສ່ຖົງໃສ່ foil ທີ່ບັນຈຸ desiccant, zip-seal the foil pouch and return to 2~8℃ as soon as possible after the use.ທາດປະສົມອື່ນໆຄວນກັບຄືນສູ່ 2 ~ 8 ℃ທັນທີທີ່ເປັນໄປໄດ້ຫຼັງຈາກການນໍາໃຊ້.

ວັດສະດຸທີ່ຕ້ອງການແຕ່ບໍ່ໄດ້ສະຫນອງ

1. ເຄື່ອງອ່ານ Microplate ທີ່ມີຕົວກອງ 450 ± 10nm (ດີກວ່າຖ້າສາມາດກວດພົບໄດ້ຢູ່ທີ່ 450 ແລະ 650 nm wavelength).

2. ເຄື່ອງສັ່ນ Microplate.

3. ຄໍາແນະນໍາທີ່ບໍ່ມີ RNase ແລະທໍ່ centrifuge.

ຕາຕະລາງການດໍາເນີນງານ

ກ່ອນທີ່ທ່ານຈະເລີ່ມຕົ້ນ

1. ເອົາສ່ວນປະກອບຂອງຊຸດແລະຕົວຢ່າງທັງຫມົດໃສ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງ (18-25 ℃) ກ່ອນທີ່ຈະນໍາໃຊ້.ຖ້າຊຸດດັ່ງກ່າວຈະບໍ່ຖືກນໍາໄປໃຊ້ໃນຄັ້ງດຽວ, ກະລຸນາເອົາພຽງແຕ່ແຜ່ນແລະທາດ reagents ອອກສໍາລັບການທົດລອງໃນປະຈຸບັນ, ແລະປ່ອຍໃຫ້ແຖບທີ່ຍັງເຫຼືອແລະ reagents ຢູ່ໃນເງື່ອນໄຂທີ່ຕ້ອງການ.

2. Wash buffer: ເຈືອຈາງ 40mL ຂອງ 20 × buffer ລ້າງເຂັ້ມຂຸ້ນດ້ວຍ 760mL ຂອງ deionized ຫຼືນ້ໍາກັ່ນເພື່ອກະກຽມ 800mL ຂອງ 1 × buffer ລ້າງ.

3. ມາດຕະຖານ: ປັ່ນ ຫຼື centrifuge ໄລຍະສັ້ນໆຂອງການແກ້ໄຂຫຼັກຊັບກ່ອນທີ່ຈະນໍາໃຊ້.ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງສີ່ມາດຕະຖານທີ່ສະຫນອງໃຫ້ແມ່ນ 5ng / μL.ສໍາລັບມາດຕະຖານ UTP ແລະ pUTP dsRNA, ກະລຸນາເຈືອຈາງການແກ້ໄຂຫຼັກຊັບເປັນ 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL ດ້ວຍ STE buffer ເພື່ອແຕ້ມເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານ.ສໍາລັບມາດຕະຖານ N1-Me-pUTP dsRNA, ກະລຸນາເຈືອຈາງການແກ້ໄຂຫຼັກຊັບເປັນ 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL ດ້ວຍ STE buffer ເພື່ອແຕ້ມເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານ.ສໍາລັບມາດຕະຖານ 5-OMe-UTP dsRNA, ກະລຸນາເຈືອຈາງການແກ້ໄຂຫຼັກຊັບເປັນ 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL ດ້ວຍ STE buffer ເພື່ອແຕ້ມເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານ.ພວກເຮົາແນະນໍາໃຫ້ມາດຕະຖານສາມາດ diluted ເປັນຕາຕະລາງດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້:

4. Biotinylated detection antibody ແລະ HRP-streptavidin work solution: ໝຸນໄລຍະສັ້ນໆ ຫຼື centrifuge ການແກ້ໄຂຫຼັກຊັບກ່ອນທີ່ຈະໃຊ້.ເຈືອຈາງພວກມັນໃຫ້ກັບຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງການເຮັດວຽກດ້ວຍ buffer dilution.

5. TMB substate: ດູດປະລິມານທີ່ຈໍາເປັນຂອງການແກ້ໄຂດ້ວຍຄໍາແນະນໍາທີ່ຂ້າເຊື້ອແລະຢ່າຖິ້ມສານທີ່ຕົກຄ້າງໃສ່ໃນຂວດອີກເທື່ອຫນຶ່ງ.ແຜ່ນຍ່ອຍ TMB ມີຄວາມອ່ອນໄຫວຕໍ່ກັບແສງ, ບໍ່ຄວນເຮັດໃຫ້ແຜ່ນຮອງ TMB ຖືກແສງເປັນເວລາດົນ.

ໃຊ້ໂປໂຕຄອນ

1. ກໍານົດຈໍານວນແຖບທີ່ຕ້ອງການສໍາລັບການວິເຄາະ.ໃສ່ເສັ້ນດ່າງໃນກອບສໍາລັບການນໍາໃຊ້.ແຖບແຜ່ນທີ່ຍັງເຫຼືອທີ່ບໍ່ໄດ້ໃຊ້ໃນການວິເຄາະນີ້ຄວນຈະຖືກບັນຈຸຢູ່ໃນຖົງຄືນດ້ວຍສານດູດຝຸ່ນ.ປິດຖົງໃຫ້ແຫນ້ນສໍາລັບການເກັບຮັກສາຕູ້ເຢັນ.

2. ຕື່ມ 100μL ແຕ່ລະ dilutions ຂອງມາດຕະຖານ, ຫວ່າງເປົ່າແລະຕົວຢ່າງເຂົ້າໄປໃນນ້ໍາທີ່ເຫມາະສົມ.ກວມເອົາດ້ວຍ sealer ແຜ່ນ.ອົບເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງດ້ວຍການສັ່ນຢູ່ທີ່ 500 rpm.ຕົວຢ່າງຄວນຖືກເຈືອຈາງດ້ວຍ STE buffer ເພື່ອຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນທີ່ເຫມາະສົມສໍາລັບການວິເຄາະທີ່ຖືກຕ້ອງ.

3. ຂັ້ນ​ຕອນ​ການ​ລ້າງ​: Aspirate ການ​ແກ້​ໄຂ​ແລະ​ລ້າງ​ດ້ວຍ 250μL wash buffer ກັບ​ແຕ່​ລະ​ດີ​ແລະ​ໃຫ້​ມັນ​ຢືນ​ສໍາ​ລັບ 30s​.ຍົກເລີກການລ້າງ buffer ຢ່າງສົມບູນໂດຍ snapping ແຜ່ນໃສ່ກະດາດດູດຊຶມ.ລ້າງທັງຫມົດ 4 ເທື່ອ.

4. ຕື່ມ 100μL ຂອງ biotinylated detection antibody ການແກ້ໄຂການເຮັດວຽກເຂົ້າໄປໃນແຕ່ລະນ້ໍາ.ກວມເອົາດ້ວຍ sealer ແຜ່ນ.ອົບເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງດ້ວຍການສັ່ນຢູ່ທີ່ 500 rpm.

5. ເຮັດຊ້ໍາຂັ້ນຕອນການລ້າງ.

6. ຕື່ມ 100μL ຂອງ HRP-streptavidin ການແກ້ໄຂການເຮັດວຽກເຂົ້າໄປໃນນ້ໍາແຕ່ລະຄົນ.ກວມເອົາດ້ວຍ sealer ແຜ່ນ.ອົບເປັນເວລາ 30 ນາທີຢູ່ທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງດ້ວຍການສັ່ນຢູ່ທີ່ 500 rpm.

7. ເຮັດຊ້ໍາຂັ້ນຕອນການລ້າງອີກເທື່ອຫນຶ່ງ.

8. ຕື່ມ 100μL ຂອງການແກ້ໄຂ TMB substrate ເຂົ້າໄປໃນແຕ່ລະດີ.ກວມເອົາດ້ວຍ sealer ແຜ່ນ.ອົບເປັນເວລາ 30 ນາທີຢູ່ທີ່ RT ປ້ອງກັນແສງ.ທາດແຫຼວຈະປ່ຽນເປັນສີຟ້າໂດຍການເພີ່ມຂອງສານລະລາຍຍ່ອຍ.

9. ຕື່ມ 50μL ຂອງການແກ້ໄຂຢຸດເຂົ້າໄປໃນແຕ່ລະດີ.ທາດແຫຼວຈະປ່ຽນເປັນສີເຫຼືອງໂດຍການເພີ່ມຂອງການແກ້ໄຂຢຸດ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ແລ່ນເຄື່ອງອ່ານ microplate ແລະດໍາເນີນການວັດແທກຢູ່ທີ່ 450nm ທັນທີ.

ການ​ຄິດ​ໄລ່​ຜົນ​ໄດ້​ຮັບ​

1. ສະເລ່ຍການອ່ານຊ້ໍາກັນສໍາລັບແຕ່ລະມາດຕະຖານ, ການຄວບຄຸມ, ແລະຕົວຢ່າງແລະລົບຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງ optical ມາດຕະຖານສະເລ່ຍສູນ.ສ້າງເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານດ້ວຍການດູດຊຶມຢູ່ໃນແກນຕັ້ງ(Y) ແລະຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ dsRNA ໃນແກນແນວນອນ(X).

2. ແນະນຳໃຫ້ເຮັດການຄຳນວນດ້ວຍຊອບແວການປັບເສັ້ນໂຄ້ງທີ່ໃຊ້ຄອມພິວເຕີເຊັ່ນ: ຜູ້ຊ່ຽວຊານດ້ານເສັ້ນໂຄ້ງ 1.3 ຫຼື ELISA Calc ໃນຮູບແບບ 5 ຫຼື 4 ພາຣາມິເຕີທີ່ບໍ່ພໍດີ.

ການປະຕິບັດ

1. ຄວາມອ່ອນໄຫວ:

ຂອບເຂດຈໍາກັດຕ່ໍາຂອງການກວດຫາ: ≤ 0.001pg/μL (ສໍາລັບ UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (ສໍາລັບ 5-OMe-UTP-dsRNA).

ຂອບເຂດຈໍາກັດຕ່ໍາຂອງປະລິມານ: 0.0156 pg/μL (ສໍາລັບ UTP-, pUTP-dsRNA), 0.0312 pg/μL (ສໍາລັບ N1-Me-pUTP-dsRNA), 0.0625 pg/μL (ສໍາລັບ 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. ຄວາມຊັດເຈນ: CV ຂອງ Intra-Assay ≤10%, CV ຂອງ Inter-Assay ≤10%

3. ການຟື້ນຕົວ: 80% ~ 120%

4.Linearity:0.0156-0.5pg/μL(forUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(forN1-Me-pUTP dsRNA),0.0625-1pg/μL(ສຳລັບ 5-OMe-UTP-dsRNA).

ການພິຈາລະນາ

1. ອຸນຫະພູມແລະເວລາຕິກິຣິຍາ TMB ແມ່ນສໍາຄັນ, ກະລຸນາຄວບຄຸມພວກມັນຕາມຄໍາແນະນໍາຢ່າງເຂັ້ມງວດ.

2. ເພື່ອບັນລຸການສືບພັນ ແລະ ຄວາມອ່ອນໄຫວຂອງການວິເຄາະທີ່ດີ, ການລ້າງຈານທີ່ຖືກຕ້ອງເພື່ອເອົາທາດປະຕິກອນທີ່ບໍ່ໄດ້ປະຕິກິລິຢາເກີນແມ່ນຈຳເປັນ.

3. ທັງຫມົດ reagents ຄວນໄດ້ຮັບການປະສົມຢ່າງລະອຽດກ່ອນທີ່ຈະນໍາໃຊ້ແລະຫຼີກເວັ້ນການ bumbles ໃນລະຫວ່າງຕົວຢ່າງຫຼືການເພີ່ມ reagents.

4. ຖ້າ​ຫາກ​ວ່າ​ໄປ​ເຊຍ​ກັນ​ໄດ້​ສ້າງ​ຕັ້ງ​ຂຶ້ນ​ໃນ buffer ລ້າງ​ສຸມ (20x​)​, ອົບ​ອຸ່ນ​ທີ່ 37 ℃​ແລະ​ປະ​ສົມ​ຄ່ອຍໆ​ຈົນ​ກ​່​ວາ​ໄປ​ເຊຍ​ກັນ​ໄດ້​ລະ​ລາຍ​ຫມົດ​.

5. ຫຼີກເວັ້ນການວິເຄາະຕົວຢ່າງທີ່ມີ Sodium Azide (NaN3), ຍ້ອນວ່າມັນສາມາດທໍາລາຍກິດຈະກໍາ HRP ທີ່ເຮັດໃຫ້ເກີດການຄາດຄະເນຂອງປະລິມານຂອງ dsRNA ຕໍ່າກວ່າ.

6. ຫຼີກເວັ້ນການປົນເປື້ອນ RNase ໃນລະຫວ່າງການກວດ.

7. ມາດຕະຖານ/ຕົວຢ່າງ, ພູມຕ້ານທານການກວດຫາ ແລະ SA-HRP ຍັງສາມາດດໍາເນີນການຢູ່ທີ່ RT ໂດຍບໍ່ມີການສັ່ນສະເທືອນ, ແຕ່ນີ້ອາດຈະເຮັດໃຫ້ຄວາມອ່ອນໄຫວໃນການກວດຫາຫຼຸດລົງຫນຶ່ງເທົ່າ.ສໍາລັບກໍລະນີນີ້, ພວກເຮົາແນະນໍາມາດຕະຖານ UTP ແລະ pUTP dsRNA ຄວນເຈືອຈາງຈາກ 2pg/μL, ມາດຕະຖານ N1-Me-pUTP dsRNA ຄວນເຈືອຈາງຈາກ 4pg/μL ແລະມາດຕະຖານ 5-OMe-UTP dsRNA ຄວນເຈືອຈາງຈາກ 8pg/μL.ນອກຈາກນັ້ນ, incubate HRP-streptavidin ການແກ້ໄຂການເຮັດວຽກສໍາລັບ 60 ນາທີຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.ຢ່າໃຊ້ເຄື່ອງປັ່ນໄຟ, ເພາະວ່າເຄື່ອງປັ່ນໄຟອາດເຮັດໃຫ້ຜົນໄດ້ຮັບບໍ່ຖືກຕ້ອງ.

ຜົນໄດ້ຮັບທົ່ວໄປ

1. ຂໍ້ມູນເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານ

2. ການຄິດໄລ່ເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານ

3. ລະດັບການກວດພົບ Liner: 0.0312- 1pg/μL