Enzyme Capping Virus ວັກຊີນ
enzyme capping ເຊື້ອໄວຣັສ Vaccinia ແມ່ນໄດ້ມາຈາກສາຍພັນ E. coli ທີ່ປະສົມພັນເອົາພັນທຸກໍາສໍາລັບເອນໄຊ Vaccinia capping.enzyme ດຽວນີ້ແມ່ນປະກອບດ້ວຍສອງຫນ່ວຍຍ່ອຍ (D1 ແລະ D12) ແລະມີສາມກິດຈະກໍາ enzymatic (RNA triphosphatase ແລະ guanylyltransferase ໂດຍຫນ່ວຍຍ່ອຍ D1 ແລະ guanine methyltransferase ໂດຍ D12 subunit).Vaccinia virus Capping Enzyme ມີປະສິດຕິຜົນໃນການກະຕຸ້ນການສ້າງໂຄງສ້າງຂອງຝາອັດປາກມົດລູກ, ເຊິ່ງໂດຍສະເພາະສາມາດຄັດຕິດໂຄງສ້າງຝາ 7-methylguanylate (m7Gppp, Cap 0) ກັບ 5′ ໃນຕອນທ້າຍຂອງ RNA.ໂຄງສ້າງຂອງ Cap (Cap 0) ມີບົດບາດສໍາຄັນໃນການສະຖຽນລະພາບ mRNA, ການຂົນສົ່ງແລະການແປໃນ eukaryotes.Capping RNA ໂດຍປະຕິກິລິຍາ enzymatic ແມ່ນວິທີການທີ່ມີປະສິດທິພາບແລະງ່າຍດາຍທີ່ສາມາດປັບປຸງຄວາມຫມັ້ນຄົງແລະການແປຂອງ RNA ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍສໍາລັບການຖ່າຍທອດໃນ vitro, transfection, ແລະ microinjection.
ອົງປະກອບ
Vaccinia Virus Capping Enzyme (10 U/μL)
10× Capping Buffer
ເງື່ອນໄຂການເກັບຮັກສາ
-25～-15℃ສໍາລັບການເກັບຮັກສາ (ຫຼີກລ້ຽງການເປັນຊ້ໍາ freeze-thaw cycles)
ພື້ນທີ່ເກັບຂໍ້ມູນ
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,
1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glycerol.
ນິຍາມຫົວໜ່ວຍ
ຫນຶ່ງຫນ່ວຍຂອງ Vaccinia virus Capping Enzyme ແມ່ນຖືກກໍານົດເປັນຈໍານວນ enzyme ທີ່ຕ້ອງການເພື່ອລວມເອົາ 10pmol ຂອງ GTP ເຂົ້າໄປໃນ 80nt transcript ໃນ 1 ຊົ່ວໂມງທີ່ 37 ° C.
ການຄວບຄຸມຄຸນນະພາບ
Exonuclease:10U ຂອງ Vaccinia virus Capping Enzyme ກັບ 1μg λ-Hind III ຍ່ອຍ DNA ທີ່ 37 ℃ສໍາລັບ 16 ຊົ່ວໂມງໃຫ້ຜົນຜະລິດບໍ່ມີການເຊື່ອມໂຊມຕາມທີ່ກໍານົດໂດຍ agarose gel electrophoresis.
Endonuclease:10U ຂອງ Vaccinia virus Capping Enzyme ທີ່ມີ 1μg λDNA ທີ່ 37 ℃ ເປັນເວລາ 16 ຊົ່ວໂມງໃຫ້ຜົນຜະລິດບໍ່ມີການເຊື່ອມໂຊມຕາມທີ່ກໍານົດໂດຍ agarose gel electrophoresis.
Nickase:10U ຂອງ Vaccinia virus Capping Enzyme ກັບ 1 μg pBR322 ທີ່ 37 ℃ສໍາລັບ 16 ຊົ່ວໂມງຜົນຜະລິດບໍ່ມີການເຊື່ອມໂຊມຕາມທີ່ກໍານົດໂດຍ agarose gel electrophoresis.
RNase:10U ຂອງ Vaccinia virus Capping Enzyme ກັບ 1.6μg MS2 RNA ສໍາລັບ 4 ຊົ່ວໂມງທີ່ 37 ℃ yields ບໍ່ມີການເຊື່ອມໂຊມຕາມກໍານົດໂດຍ agarose gel electrophoresis.
1.coli DNA:10U ຂອງ Vaccinia virus Capping Enzyme ຖືກກວດຫາການປະກົດຕົວຂອງ E. coli genomic DNA ໂດຍໃຊ້ TaqMan qPCR ກັບ primers ສະເພາະສໍາລັບ E. coli 16S rRNA locus.ການປົນເປື້ອນ genomic DNA ຂອງ E. coli ແມ່ນ≤1 E. coli genome.
2.ເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ Endotoxin: LAL-test, ອີງຕາມການຈີນ Pharmacopoeia IV 2020 edition, gel limit test method, general rule (1143).ປະລິມານ endotoxin ເຊື້ອແບັກທີເຣັຍຄວນຈະເປັນ ≤10 EU/mg.
ລະບົບປະຕິກິລິຍາແລະເງື່ອນໄຂ
1. Capping Protocol (ປະລິມານປະຕິກິລິຍາ: 20 μL)
ຂັ້ນຕອນນີ້ແມ່ນໃຊ້ໄດ້ກັບປະຕິກິລິຍາ capping ຂອງ 10μg RNA (≥100 nt) ແລະມັນສາມາດຂະຫຍາຍໄດ້ຕາມຄວາມຕ້ອງການໃນການທົດລອງ.
I) ສົມທົບ 10μg RNA ແລະ H2O ທີ່ບໍ່ມີນິວເຄລຍໃນທໍ່ microfuge 1.5 ມລກັບປະລິມານສຸດທ້າຍຂອງ 15.0 µL.*10× Capping Buffer: 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8.0)
2) ຄວາມຮ້ອນທີ່ 65 ℃ສໍາລັບການ 5 ນາທີປະຕິບັດຕາມດ້ວຍການອາບນ້ໍາກ້ອນສໍາລັບການ 5 ນາທີ.
3) ເພີ່ມອົງປະກອບດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້ໃນຄໍາສັ່ງທີ່ກໍານົດໄວ້
| Cອົງປະກອບ | Vໝາກກ້ຽງ |
| Denatured RNA (≤10μg, length≥100 nt) | 15 ມລ |
| 10× Capping Buffer* | 2 ມລ |
| GTP (10 ມມ) | 1 μL |
| SAM (2 ມມ) | 1 μL |
| Vaccinia virus Capping Enzyme (10U/μL) | 1 μL |
* 10 × Capping Buffer: 0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH8.0)
4) ອົບທີ່ອຸນຫະພູມ 37 ອົງສາ C ເປັນເວລາ 30 ນາທີ, ປະຈຸບັນ RNA ຖືກປິດໄວ້ ແລະ ກຽມພ້ອມສຳລັບການນຳໃຊ້ລຸ່ມນ້ຳ.
2. 5′ terminal ປະຕິກິລິຍາການຕິດສະຫຼາກ (ປະລິມານປະຕິກິລິຍາ: 20 μL)
ອະນຸສັນຍານີ້ຖືກອອກແບບມາເພື່ອຕິດສະຫຼາກ RNA ທີ່ມີ 5′ triphosphate ແລະມັນສາມາດຂະຫຍາຍໄດ້ຕາມຄວາມຕ້ອງການ.ປະສິດທິພາບຂອງການລວມປ້າຍຊື່ຈະໄດ້ຮັບຜົນກະທົບຈາກອັດຕາສ່ວນ molar ຂອງ RNA: GTP, ເຊັ່ນດຽວກັນກັບເນື້ອໃນ GTP ໃນຕົວຢ່າງ RNA.
1) ປະສົມປະລິມານທີ່ເຫມາະສົມຂອງ RNA ແລະ H2O ປອດນິວເຄລຍໃນທໍ່ microfuge 1.5 ມລເພື່ອປະລິມານສຸດທ້າຍຂອງ 14.0 µL.
2) ຄວາມຮ້ອນທີ່ 65 ℃ສໍາລັບການ 5 ນາທີປະຕິບັດຕາມດ້ວຍການອາບນ້ໍາກ້ອນສໍາລັບການ 5 ນາທີ.
3) ເພີ່ມອົງປະກອບດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້ໃນຄໍາສັ່ງທີ່ລະບຸໄວ້.
| Cອົງປະກອບ | Vໝາກກ້ຽງ |
| RNA ທີ່ເປັນຕົວຕົນ | 14 ມລ |
| 10× Capping Buffer | 2 ມລ |
| ປະສົມ GTP ** | 2 ມລ |
| SAM (2 ມມ) | 1 μL |
| Vaccinia virus Capping Enzyme (10U/μL) | 1 μL |
** GTP MIX ຫມາຍເຖິງ GTP ແລະເຄື່ອງຫມາຍຈໍານວນນ້ອຍໆ.ສໍາລັບຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ GTP, ເບິ່ງຫມາຍເຫດ 3.
4) ອົບທີ່ອຸນຫະພູມ 37 ອົງສາ C ເປັນເວລາ 30 ນາທີ, RNA 5′ ສິ້ນສຸດໄດ້ຖືກຕິດສະຫຼາກແລະກຽມພ້ອມສໍາລັບການລົງລຸ່ມ.
ຄໍາຮ້ອງສະຫມັກ
1. Capping mRNA ກ່ອນການແປພາສາ assays/in vitro translation
2. ການຕິດປ້າຍ 5´ ສິ້ນສຸດຂອງ mRNA
ຫມາຍເຫດກ່ຽວກັບການນໍາໃຊ້
1.ການໃຫ້ຄວາມຮ້ອນການແກ້ໄຂຂອງ RNA ກ່ອນທີ່ຈະ incubation ດ້ວຍ Vaccinia Capping Enzyme ເອົາໂຄງສ້າງຂັ້ນສອງໃນ 5'end ຂອງ transcript.ຂະຫຍາຍເວລາເປັນ 60 ນາທີສຳລັບບົດບັນທຶກທີ່ມີໂຄງສ້າງ 5'ends ທີ່ຮູ້ຈັກ.
2. RNA ທີ່ໃຊ້ສໍາລັບປະຕິກິລິຍາ capping ຄວນຖືກຊໍາລະກ່ອນການນໍາໃຊ້ແລະຖືກໂຈະຢູ່ໃນນ້ໍາທີ່ບໍ່ມີນິວເຄລຍ.EDTA ບໍ່ຄວນມີຢູ່ແລະການແກ້ໄຂຄວນຈະບໍ່ມີເກືອ.
3. ສໍາລັບການຕິດສະຫຼາກ 5′, ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ GTP ທັງຫມົດຄວນຈະປະມານ 1-3 ເທົ່າຂອງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ molar ຂອງ mRNA ໃນຕິກິຣິຍາ.
4. ປະລິມານຂອງລະບົບຕິກິຣິຍາສາມາດປັບຂະຫນາດຂຶ້ນຫຼືຫຼຸດລົງຕາມຄວາມເປັນຈິງ.
