RTL Reverse Transcriptase
RTL reverse transcriptase ແມ່ນ RNA polymerase ທີ່ຂຶ້ນກັບແມ່ແບບ RNA ທີ່ຂາດກິດຈະກໍາ exonuclease 3'→5' ແລະມີກິດຈະກໍາ RNase H.ເອນໄຊນີ້ສາມາດໃຊ້ RNA ເປັນແມ່ແບບເພື່ອສັງເຄາະ strand ເສີມຂອງ DNA, ເຊິ່ງສາມາດນໍາໃຊ້ກັບການສັງເຄາະ cDNA ສາຍທໍາອິດ, ໂດຍສະເພາະສໍາລັບການ RT-LAMP (loop-mediated isothermal amplification).ເມື່ອປຽບທຽບກັບ RTL reverse transcriptase 1.0, ຄວາມອ່ອນໄຫວໄດ້ຖືກປັບປຸງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ, ຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງຄວາມຮ້ອນແມ່ນເຂັ້ມແຂງ, ແລະປະຕິກິລິຍາຢູ່ທີ່ 65 ° C ແມ່ນມີຄວາມຫມັ້ນຄົງຫຼາຍ.RTL reverse transcriptase (glycerol ຟຣີ) ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກະກຽມການກະກຽມ lyophilized, lyophilized reagents RT-LAMP ແລະອື່ນໆ.
ນິຍາມຫົວໜ່ວຍ
ໜ່ວຍໜຶ່ງຈະລວມເອົາ 1 nmol ຂອງ dTTP ເຂົ້າໄປໃນວັດສະດຸທີ່ເກີດອາຊິດ-precipitable ໃນ 20 ນາທີຢູ່ທີ່ 50 ° C ໂດຍໃຊ້ poly(A)•oligo(dT)25 ເປັນແມ່ແບບ-primer.
ອົງປະກອບ
| ອົງປະກອບ | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Reverse Transcriptase (ບໍ່ມີ Glycerol) (15U/μL) | 0.1 ມລ | 1 ມລ | 10 ມລ |
| 10×HC RTL Buffer | 1.5 ມລ | 4×1.5 ມລ | 5×10 ມລ |
| MgSO4 (100 ມມ) | 1.5 ມລ | 2×1.5 ມລ | 3×10 ມລ |
ເງື່ອນໄຂການເກັບຮັກສາ
ການຂົນສົ່ງພາຍໃຕ້ 0 ° C ແລະຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -25 ° C ~ -15 ° C.
ການຄວບຄຸມຄຸນນະພາບ
- ກິດຈະກໍາການຕົກຄ້າງຂອງEndonuclease:A 50 μLຕິກິຣິຍາປະກອບດ້ວຍ 1 μgຂອງ λDNA ແລະ 15 ຫນ່ວຍຂອງ RTL2.0 incubated ສໍາລັບ 16 ຊົ່ວໂມງທີ່ 37 ℃ສະແດງໃຫ້ເຫັນຮູບແບບດຽວກັນກັບການຄວບຄຸມທາງລົບໂດຍ gel electrophoresis.
- ກິດຈະກໍາການຕົກຄ້າງຂອງExonuclease:A 50 μLຕິກິຣິຍາປະກອບດ້ວຍ 1 μgຂອງ Hind Ⅲຍ່ອຍ λDNA ແລະ 15 ຫນ່ວຍຂອງ RTL2.0 incubated ສໍາລັບ 16 ຊົ່ວໂມງທີ່ 37 ℃ສະແດງໃຫ້ເຫັນຮູບແບບດຽວກັນກັບການຄວບຄຸມທາງລົບໂດຍ gel electrophoresis.
- ກິດຈະກໍາການຕົກຄ້າງຂອງNickase:ປະຕິກິລິຍາ 50 μL ບັນຈຸ 1 μgຂອງ supercoiled pBR322 ແລະ 15 ຫນ່ວຍຂອງ RTL2.0 incubated ສໍາລັບ 4 ຊົ່ວໂມງທີ່ 37 ° C ສະແດງຮູບແບບດຽວກັນກັບການຄວບຄຸມທາງລົບໂດຍ gel electrophoresis.
- ກິດຈະກໍາການຕົກຄ້າງຂອງRNase:ປະຕິກິລິຍາ 10 μL ບັນຈຸ 0.48 μg ຂອງ MS2 RNA ແລະ 15 ຫນ່ວຍຂອງ RTL2.0 incubated ສໍາລັບ 4 ຊົ່ວໂມງທີ່ 37 ° C ສະແດງຮູບແບບດຽວກັນກັບການຄວບຄຸມທາງລົບໂດຍ gel electrophoresis.
- E. coli gDNA:ວັດແທກດ້ວຍE.coliຊຸດກວດຫາ HCD ສະເພາະ, 15 ໜ່ວຍຂອງ RTL2.0 ມີໜ້ອຍກວ່າ 1E. coligenome.
ການຕັ້ງຄ່າປະຕິກິລິຍາ
ອະນຸສັນຍາການສັງເຄາະ cDNA
| ອົງປະກອບ | ປະລິມານ |
| ແມ່ແບບ RNA ກ | ທາງເລືອກ |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) ຫຼືປະສົມ Primer Random(60uM) | 2 ມລ |
| dNTP Mix (10mM ແຕ່ລະອັນ) | 1 μL |
| RNase inhibitor (40U/uL) | 0.5 ມລ |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0.5 ມລ |
| 10×HC RTL Buffer | 2 ມລ |
| ນ້ໍາທີ່ບໍ່ມີນິວເຄລຍ | ສູງເຖິງ 20 μL |
ໝາຍເຫດ:
1) ປະລິມານທີ່ແນະນໍາຂອງ Total RNA ແມ່ນ 1ng ~ 1μg
2) ປະລິມານທີ່ແນະນໍາຂອງ mRNA ແມ່ນ 50ng ~ 100ng
ອຸນຫະພູມ-ເງື່ອນໄຂການຂີ່ລົດຖີບສໍາລັບການປົກກະຕິ ປະຕິກິລິຍາ:
| ອຸນຫະພູມ (°C) | ເວລາ |
| 25°Ca | 5 ນາທີ |
| 55°C | 10 ນາທີb |
| 80 °C | 10 ນາທີ |
ໝາຍເຫດ:
1) ຖ້າຫາກວ່າການປະສົມ Primer Random ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້, ຂັ້ນຕອນການ incubation ທີ່ 25°C.
2) ຖ້າຫາກວ່າການປະສົມ primer ເປົ້າຫມາຍແມ່ນການນໍາໃຊ້, ຂັ້ນຕອນການ incubation ທີ່ 55 ° C ສໍາລັບການ 10 ~ 30 ນາທີ.
RT-LAMP Protocol
| ອົງປະກອບ | ປະລິມານ | ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສຸດທ້າຍ |
| ແມ່ແບບ RNA | ທາງເລືອກ | ≥10 ສະບັບ |
| dNTP Mix (10mM) | 3.5 ມລ | 1.4 ມມ |
| FIP/BIP Primers (25×) | 1 μL | 1.6 ມມ |
| F3/B3 primers (25×) | 1 μL | 0.2 ມມ |
| LoopF/LoopB Primers (25×) | 1 μL | 0.4 ມມ |
| RNase inhibitor (40U/μL) | 0.5 ມລ | 20 U/ຕິກິຣິຍາ |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0.5 ມລ | 7.5 U/ຕິກິຣິຍາ |
| Bst V2 DNA Polymerase (8U/μL) | 1 μL | 8 U/ຕິກິຣິຍາ |
| MgSO4 (100 ມມ) | 1.5 ມລ | 6 mM (ລວມ 8 mM) |
| 10×HC RTL Buffer (ຫຼື 10×HC Bst V2 Buffer) | 2.5 ມລ | 1 × (2 ມມ Mg2+) |
| ນ້ໍາທີ່ບໍ່ມີນິວເຄລຍ | ສູງເຖິງ 25 μL | - |
ໝາຍເຫດ:
1) ປະສົມໂດຍ vortexing ແລະ centrifuge ໄລຍະສັ້ນໆເພື່ອເກັບກໍາ.ອຸນຫະພູມຄົງທີ່ incubation ຢູ່ທີ່ 65°C ສໍາລັບການ 1 ຊົ່ວໂມງ.
2) ສອງ buffers ແມ່ນ interoperable ແລະມີອົງປະກອບດຽວກັນ.
ບັນທຶກ
1. ຜະລິດຕະພັນນີ້ຈະປະກອບເປັນແຂງສີຂາວເມື່ອເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -20 °C.ເອົາມັນອອກຈາກ -20 ອົງສາ C ແລະເອົາໃສ່ໃນກ້ອນປະມານ 10 ນາທີ.ຫຼັງຈາກການລະລາຍ, ມັນສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ໂດຍການສັ່ນແລະປະສົມ.
2. ຜະລິດຕະພັນ cDNA ສາມາດຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -20 ° C ຫຼື -80 ° C ຫຼືຖືກນໍາໃຊ້ທັນທີສໍາລັບການຕິກິຣິຍາ PCR.
3. ເພື່ອປ້ອງກັນການປົນເປື້ອນ RNase, ກະລຸນາຮັກສາພື້ນທີ່ທົດລອງໃຫ້ສະອາດ, ແລະໃສ່ຖົງມືທີ່ສະອາດແລະຫນ້າກາກໃນລະຫວ່າງການປະຕິບັດງານ.
