PNGase F
Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F) ແມ່ນວິທີການ enzymatic ທີ່ມີປະສິດທິຜົນທີ່ສຸດສໍາລັບການຖອນເກືອບທັງຫມົດ N-linked oligosaccharides ຈາກ glycoproteins.PNGase F ແມ່ນ amidase, ເຊິ່ງຢູ່ລະຫວ່າງ GlcNAc ສ່ວນໃຫຍ່ພາຍໃນແລະ asparagine residues ຂອງ mannose ສູງ, ປະສົມ, ແລະ oligosaccharides ສະລັບສັບຊ້ອນຈາກ glycoproteins N-linked.
ຄໍາຮ້ອງສະຫມັກ
enzyme ນີ້ແມ່ນເປັນປະໂຫຍດສໍາລັບການກໍາຈັດຄາໂບໄຮເດດ residue ຈາກທາດໂປຼຕີນ.
ການກະກຽມແລະການກໍານົດ
| ຮູບລັກສະນະ | ທາດແຫຼວທີ່ບໍ່ມີສີ |
| ຄວາມບໍລິສຸດຂອງທາດໂປຼຕີນ | ≥95% (ຈາກ SDS-PAGE) |
| ກິດຈະກໍາ | ≥500,000 U/ml |
| Exoglycosidase | ບໍ່ມີການເຄື່ອນໄຫວສາມາດກວດພົບໄດ້ (ND) |
| Endoglycosidase F1 | ND |
| Endoglycosidase F2 | ND |
| Endoglycosidase F3 | ND |
| Endoglycosidase H | ND |
| ໂປຣຕີນ | ND |
ຄຸນສົມບັດ
| ໝາຍເລກ EC | 3.5.1.52(ປະສົມຈາກຈຸລິນຊີ) |
| ນ້ຳໜັກໂມເລກຸນ | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| ຈຸດ isoelectric | 8. 14 |
| pH ທີ່ດີທີ່ສຸດ | 7.0-8.0 |
| ອຸນຫະພູມທີ່ດີທີ່ສຸດ | 65°C |
| ສະເພາະ substrate | ການແຍກພັນທະບັດ glycosidic ລະຫວ່າງ GlcNAc ແລະ residue asparagine Fig.1 |
| ສະຖານທີ່ຮັບຮູ້ | N-linked glycans ເວັ້ນເສຍແຕ່ມີ α1-3 fucose ຮູບ 2 |
| ຕົວກະຕຸ້ນ | DTT |
| ຢາຍັບຍັ້ງ | SDS |
| ອຸນຫະພູມການເກັບຮັກສາ | -25 ~-15 ℃ |
| ການກະຕຸ້ນຄວາມຮ້ອນ | ທາດປະສົມປະຕິກິລິຍາ 20µL ບັນຈຸ 1µL ຂອງ PNGase F ແມ່ນ inactivated ໂດຍ incubation ຢູ່ທີ່ 75 °C ເປັນເວລາ 10 ນາທີ. |
Fig. 1 ຄວາມສະເພາະຂອງ Substrate ຂອງ PNGase F
Fig. 2 ການຮັບຮູ້ຂອງ PNGase F.
ເມື່ອສານຕົກຄ້າງ GlcNAc ພາຍໃນເຊື່ອມຕໍ່ກັບ α1-3 fucose, PNGase F ບໍ່ສາມາດແຍກ oligosaccharides N-linked ຈາກ glycoproteins.ການດັດແກ້ນີ້ແມ່ນມີຢູ່ໃນພືດແລະແມງໄມ້ບາງ glycoproteins.
Cອົງປະກອບ
|
| ອົງປະກອບ | ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10× Glycoprotein Denaturing Buffer | 1000 µl |
| 3 | 10× GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
ນິຍາມຫົວໜ່ວຍ
ຫນຶ່ງຫນ່ວຍ (U) ຖືກກໍານົດເປັນຈໍານວນ enzyme ທີ່ຕ້ອງການເພື່ອເອົາ > 95% ຂອງຄາໂບໄຮເດດຈາກ 10 µg ຂອງ RNase B denatured ໃນ 1 ຊົ່ວໂມງທີ່ 37 ° C ໃນປະລິມານຕິກິຣິຍາທັງຫມົດ 10 µL.
ເງື່ອນໄຂປະຕິກິລິຍາ
1.ລະລາຍ 1-20 µg ຂອງ glycoprotein ດ້ວຍນ້ໍາ deionized, ເພີ່ມ 1 µl 10 × Glycoprotein Denaturing Buffer ແລະ H2O (ຖ້າຈໍາເປັນ) ເພື່ອເຮັດໃຫ້ປະລິມານຕິກິຣິຍາທັງຫມົດ 10 µl.
2.ອົບທີ່ 100 ອົງສາ C ເປັນເວລາ 10 ນາທີ, ແຊ່ເຢັນໃສ່ກ້ອນ.
3.ຕື່ມ 2 µl 10 × GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 ແລະປະສົມ.
4.ເພີ່ມ 1-2 µl PNGase F ແລະ H2O (ຖ້າຈໍາເປັນ) ເພື່ອເຮັດໃຫ້ປະລິມານປະຕິກິລິຢາທັງຫມົດ 20 µl ແລະປະສົມ.
5.ອົບປະຕິກິລິຍາຢູ່ທີ່ 37 ອົງສາ C ເປັນເວລາ 60 ນາທີ.
6.ສໍາລັບການວິເຄາະ SDS-PAGE ຫຼືການວິເຄາະ HPLC.
