Rnase inhibitor
Murine RNase inhibitor ແມ່ນສານຍັບຍັ້ງ murine RNase ທີ່ປະສົມປະສານທີ່ສະແດງອອກແລະບໍລິສຸດຈາກ E.coli.ມັນຜູກມັດກັບ RNase A, B ຫຼື C ໃນອັດຕາສ່ວນ 1: 1 ໂດຍຜ່ານການຜູກມັດທີ່ບໍ່ແມ່ນ covalent, ດັ່ງນັ້ນການຍັບຍັ້ງກິດຈະກໍາຂອງສາມເອນໄຊແລະປົກປ້ອງ RNA ຈາກການເຊື່ອມໂຊມ.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ມັນບໍ່ມີປະສິດຕິຜົນຕໍ່ກັບ RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H ຫຼື RNase ຈາກ Aspergillus.Murine RNase inhibitor ໄດ້ຖືກທົດສອບໂດຍ RT-PCR, RT-qPCR ແລະ IVT mRNA, ແລະເຂົ້າກັນໄດ້ກັບ transcriptases Reverse ການຄ້າຕ່າງໆ, DNA polymerases ແລະ RNA polymerases.
ເມື່ອປຽບທຽບກັບສານຍັບຍັ້ງ RNase ຂອງມະນຸດ, murine RNase inhibitor ບໍ່ມີສອງ cysteine ທີ່ມີຄວາມອ່ອນໄຫວສູງຕໍ່ການຜຸພັງເຊິ່ງເຮັດໃຫ້ເກີດການກະຕຸ້ນຂອງ inhibitor.ທີ່ເຮັດໃຫ້ມີຄວາມຫມັ້ນຄົງຢູ່ທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຕ່ໍາຂອງ DTT (ຫນ້ອຍກວ່າ 1 mM).ຄຸນນະສົມບັດນີ້ເຮັດໃຫ້ມັນເຫມາະສົມສໍາລັບການນໍາໃຊ້ໃນຕິກິລິຍາທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງຂອງ DTT ກົງກັນຂ້າມກັບປະຕິກິລິຍາ (ເຊັ່ນ: RT-PCR ໃນເວລາຈິງ).
Aຄໍາຮ້ອງສະຫມັກ
ຜະລິດຕະພັນນີ້ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງໃນການທົດລອງໃດໆທີ່ການແຊກແຊງ RNase ເປັນໄປໄດ້ເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການທໍາລາຍ RNA, ເຊັ່ນ:
1.ການສັງເຄາະສາຍທຳອິດຂອງ cDNA, RT-PCR, RT-qPCR, ແລະອື່ນໆ.
2.ປົກປ້ອງ RNA ຈາກການເຊື່ອມໂຊມໃນລະຫວ່າງການຖ່າຍທອດ/ການແປໃນ vitro (ເຊັ່ນ: ລະບົບການຈໍາລອງໄວຣັສໃນ vitro).
3.ການຍັບຍັ້ງກິດຈະກໍາ RNase ໃນລະຫວ່າງການແຍກ RNA ແລະການເຮັດຄວາມສະອາດ.
ເງື່ອນໄຂການເກັບຮັກສາ
ຜະລິດຕະພັນສາມາດເກັບຮັກສາໄດ້ຢູ່ທີ່ -25～-15 ℃, ມີອາຍຸ 2 ປີ.
ພື້ນທີ່ເກັບຂໍ້ມູນ
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.6, 25 ℃), 8 mM DTT ແລະ 50% glycerol.
ນິຍາມຫົວໜ່ວຍ
ປະລິມານຂອງ murine RNase inhibitor ທີ່ຕ້ອງການເພື່ອຍັບຍັ້ງກິດຈະກໍາຂອງ 5ng ຂອງ ribonuclease A ໂດຍ 50% ໄດ້ຖືກກໍານົດເປັນຫນຶ່ງຫນ່ວຍ (U).
ນ້ໍາຫນັກໂມເລກຸນຂອງທາດໂປຼຕີນ
ນ້ໍາຫນັກໂມເລກຸນຂອງ murine RNase inhibitor ແມ່ນ 50 kDa.
ການຄວບຄຸມຄຸນນະພາບ
Exonuclease ການເຄື່ອນໄຫວ:
40 U ຂອງ murine RNase inhibitor ກັບ 1 μg λ -Hind III ຍ່ອຍ DNA ທີ່ 37 ℃ສໍາລັບ 16 ຊົ່ວໂມງຜົນຜະລິດບໍ່ມີການເຊື່ອມໂຊມຕາມທີ່ກໍານົດໂດຍ agarose gel electrophoresis.
ກິດຈະກໍາ Endonuclease:
40 U ຂອງ murine RNase inhibitor ກັບ 1μ g λ DNA ຢູ່ທີ່ 37 ℃ສໍາລັບ 16 ຊົ່ວໂມງຜົນຜະລິດບໍ່ມີການເຊື່ອມໂຊມຕາມທີ່ກໍານົດໂດຍ agarose gel electrophoresis.
Nicking ການເຄື່ອນໄຫວ:
40U ຂອງ murine RNase inhibitor ກັບ 1μ g pBR322 ຢູ່ທີ່ 37 ℃ສໍາລັບ 16 ຊົ່ວໂມງຜົນຜະລິດບໍ່ມີການເຊື່ອມໂຊມຕາມທີ່ກໍານົດໂດຍ agarose gel electrophoresis.
RNase ກິດຈະກໍາ:
40U ຂອງ murine RNase inhibitor ກັບ 1.6μ g MS2 RNA ສໍາລັບ 4h ທີ່ 37 ℃ yields ບໍ່ມີການເຊື່ອມໂຊມຕາມກໍານົດໂດຍ agarose gel electrophoresis.
E.coli DNA:
40 U ຂອງ murine RNase inhibitor ຖືກກວດຫາການປະກົດຕົວຂອງ E. coli genomic DNA ໂດຍໃຊ້ TaqMan qPCR ກັບ primers ສະເພາະສໍາລັບ E. coli 16S rRNA locus.ການປົນເປື້ອນ DNA genomic ຂອງ E. coli ແມ່ນ ≤ 0.1 pg/40 U.
Notes
1.ການສັ່ນສະເທືອນ ຫຼືການປັ່ນປ່ວນຮຸນແຮງຈະນຳໄປສູ່ການກະຕຸ້ນເອນໄຊ.
2.The optimum temperature range of this inhibitor is 25-55 ℃ , ແລະມັນໄດ້ຖືກ inactivated ຢູ່ທີ່ 65 ℃ແລະຂ້າງເທິງ.
3. ກິດຈະກໍາຂອງ RNase H, RNase 1 ແລະ RNase T1 ບໍ່ໄດ້ຖືກຍັບຍັ້ງໂດຍ murine RNase inhibitor.
4. ການຍັບຍັ້ງກິດຈະກໍາ RNase ໄດ້ຖືກພົບເຫັນຢູ່ໃນຄວາມກວ້າງຂອງ pH (pH 5-9 ທັງຫມົດແມ່ນການເຄື່ອນໄຫວ), ແລະກິດຈະກໍາທີ່ສູງທີ່ສຸດແມ່ນສັງເກດເຫັນຢູ່ທີ່ pH 7-8.
5.ນັບຕັ້ງແຕ່ ribonucleases ປົກກະຕິແລ້ວຮັກສາກິດຈະກໍາພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂ denaturing, ຕ້ອງໄດ້ຮັບການດູແລເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການ denaturing ໂມເລກຸນ RNase Inhibitor ທີ່ສັບສົນກັບ ribonuclease.ເພື່ອປ້ອງກັນການປ່ອຍ ribonuclease ທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວ, ອຸນຫະພູມທີ່ສູງກວ່າ 50 °C ແລະຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງຂອງ urea ຫຼືສານຕ້ານອະນຸມູນອິສະລະອື່ນໆຄວນໄດ້ຮັບການຫຼີກເວັ້ນ.
