ຊຸດ Mouse Genotyping

ໝາຍເລກແມວ: HCR2021A

ຜະລິດຕະພັນນີ້ແມ່ນຊຸດທີ່ຖືກອອກແບບມາສໍາລັບການກໍານົດຢ່າງໄວວາຂອງ genotypes ຂອງຫນູ, ລວມທັງການສະກັດເອົານ້ໍາມັນດິບ DNA ແລະລະບົບການຂະຫຍາຍ PCR.ຜະລິດຕະພັນສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການຂະຫຍາຍ PCR ໂດຍກົງຈາກຫາງຫນູ, ຫູ, toe ແລະແພຈຸລັງອື່ນໆຫຼັງຈາກ cleavage ງ່າຍດາຍໂດຍ Lysis Buffer ແລະ Proteinase k.ບໍ່ມີການຍ່ອຍອາຫານຂ້າມຄືນ, ການສະກັດເອົາ phenol-chloroform ຫຼືການຊໍາລະລ້າງຖັນ, ເຊິ່ງງ່າຍດາຍແລະຫຼຸດຜ່ອນເວລາຂອງການທົດລອງ.ຜະລິດຕະພັນແມ່ນເຫມາະສົມສໍາລັບການຂະຫຍາຍຊິ້ນສ່ວນເປົ້າຫມາຍເຖິງ 2kb ແລະຕິກິຣິຍາ PCR multiplex ທີ່ມີເຖິງ 3 ຄູ່ primers.ການປະສົມ 2 × Mouse Tissue Direct PCR ປະກອບດ້ວຍ DNA polymerase ທີ່ຖືກວິສະວະກໍາພັນທຸກໍາ, Mg²⁺, dNTPs ແລະລະບົບ buffer ທີ່ດີທີ່ສຸດເພື່ອໃຫ້ປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍສູງແລະຄວາມທົນທານຂອງ inhibitor, ດັ່ງນັ້ນປະຕິກິລິຍາ PCR ສາມາດດໍາເນີນການໄດ້ໂດຍການເພີ່ມແມ່ແບບແລະ primers ແລະ rehydrating ຜະລິດຕະພັນ 1 ×.ຜະລິດຕະພັນ PCR ຂະຫຍາຍດ້ວຍຜະລິດຕະພັນນີ້ມີພື້ນຖານ "A" ທີ່ໂດດເດັ່ນຢູ່ປາຍ 3′ ແລະສາມາດນໍາໃຊ້ໄດ້ໂດຍກົງສໍາລັບການໂຄນ TA ຫຼັງຈາກການຊໍາລະລ້າງ.

ອົງປະກອບ

ເງື່ອນໄຂການເກັບຮັກສາ

ຜະລິດຕະພັນຄວນເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -25 ~ -15 ℃ 2 ປີ.ຫຼັງຈາກ thawing, Lysis Buffer ສາມາດເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ 2 ~ 8 ℃ສໍາລັບການນໍາໃຊ້ຫຼາຍໃນໄລຍະສັ້ນ, ແລະປະສົມໃຫ້ດີໃນເວລານໍາໃຊ້.

ຄໍາຮ້ອງສະຫມັກ

ຜະລິດຕະພັນນີ້ແມ່ນເຫມາະສົມສໍາລັບການວິເຄາະ knockout ຫນູ, ການກວດຫາ transgenic, genotyping ແລະອື່ນໆ.

ຄຸນ​ລັກ​ສະ​ນະ

1.ການດໍາເນີນງານງ່າຍດາຍ: ບໍ່ຈໍາເປັນຕ້ອງສະກັດ DNA genomic;

2.ຄໍາຮ້ອງສະຫມັກກ້ວາງ: ເຫມາະສົມສໍາລັບການຂະຫຍາຍໂດຍກົງຂອງເນື້ອເຍື່ອຫນູຕ່າງໆ.

ຄໍາແນະນໍາ

1.ການປ່ອຍຕົວຂອງ DNA ພັນທຸ ກຳ

1) ການກະກຽມຂອງ lysate

Tissue lysate ໄດ້ຖືກກະກຽມຕາມຈໍານວນຂອງຕົວຢ່າງຫນູທີ່ຈະ lysed (ເນື້ອເຍື່ອ lysate ຄວນຖືກກະກຽມຢູ່ໃນບ່ອນຕາມປະລິມານແລະປະສົມຢ່າງລະອຽດສໍາລັບການນໍາໃຊ້), ແລະອັດຕາສ່ວນຂອງ reagents ທີ່ຕ້ອງການສໍາລັບຕົວຢ່າງດຽວແມ່ນດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້:

2) ການກະກຽມຕົວຢ່າງແລະ Lysis

ແນະນໍາໃຫ້ໃຊ້ Tissue

ເອົາຕົວຢ່າງເນື້ອເຍື່ອຫນູໃນປະລິມານທີ່ເຫມາະສົມໃນທໍ່ centrifuge ທີ່ສະອາດ, ເພີ່ມ 200μL ຂອງເນື້ອເຍື່ອສົດ lysate ໃສ່ແຕ່ລະທໍ່ centrifuge, vortex ແລະສັ່ນ, ຫຼັງຈາກນັ້ນ incubate ທີ່ 55 ℃ສໍາລັບ 30 ນາທີ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນໃຫ້ຄວາມຮ້ອນຢູ່ທີ່ 98 ℃ສໍາລັບ 3 ນາທີ.

3) Centrifugation

ສັ່ນ lysate ໄດ້ດີແລະ centrifuge ທີ່ 12,000 rpm ສໍາລັບ 5 ນາທີ.supernatant ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເປັນແມ່ແບບສໍາລັບການຂະຫຍາຍ PCR.ຖ້າແມ່ແບບຕ້ອງການສໍາລັບການເກັບຮັກສາ, ໂອນ supernatant ໄປໃສ່ທໍ່ centrifuge ອື່ນທີ່ເປັນຫມັນແລະເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -20 ℃ເປັນເວລາ 2 ອາທິດ.

2.ການຂະຫຍາຍ PCR

ເອົາ 2 × Mouse Tissue Direct PCR Mix ຈາກ -20 ℃ ແລະ thaw ເທິງກ້ອນ, ປະສົມກັບ upside ລົງແລະກະກຽມລະບົບປະຕິກິລິຍາ PCR ຕາມຕາຕະລາງຕໍ່ໄປນີ້ (ດໍາເນີນການເທິງກ້ອນ):

ຫມາຍ​ເຫດ​:

a) ປະລິມານທີ່ເພີ່ມບໍ່ຄວນເກີນ 1/10 ຂອງລະບົບ, ແລະຖ້າເພີ່ມຫຼາຍເກີນໄປ, PCR amplification ອາດຈະຖືກຍັບຍັ້ງ.

ເງື່ອນໄຂ PCR ທີ່ແນະນໍາ

ຫມາຍ​ເຫດ​:

a) ອຸນຫະພູມ Annealing: ໂດຍອ້າງອີງໃສ່ຄ່າ Tm ຂອງ primer, ແນະນໍາໃຫ້ຕັ້ງອຸນຫະພູມ annealing ກັບຄ່າ Tm ນ້ອຍກວ່າ primer +3 ~ 5 ℃.

ບັນຫາທົ່ວໄປແລະວິທີແກ້ໄຂ

1.ບໍ່ມີແຖບເປົ້າໝາຍ

1) ຜະລິດຕະພັນ lysis ຫຼາຍເກີນໄປ.ເລືອກຈໍານວນທີ່ເຫມາະສົມທີ່ສຸດຂອງແມ່ແບບ, ປົກກະຕິແລ້ວບໍ່ເກີນ 1/10 ຂອງລະບົບ;

2) ຂະຫນາດຕົວຢ່າງຂະຫນາດໃຫຍ່ເກີນໄປ.ເຈືອຈາງ lysate 10 ເທື່ອແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຂະຫຍາຍ, ຫຼືຫຼຸດລົງຂະຫນາດຕົວຢ່າງແລະ re-lysis;

3) ຕົວຢ່າງເນື້ອເຍື່ອບໍ່ສົດ.ມັນແນະນໍາໃຫ້ໃຊ້ຕົວຢ່າງເນື້ອເຍື່ອສົດ;

4) ຄຸນນະພາບ primer ບໍ່ດີ.ໃຊ້ DNA genomic ສໍາລັບການຂະຫຍາຍເພື່ອກວດສອບຄຸນນະພາບ primer ແລະເພີ່ມປະສິດທິພາບການອອກແບບ primer.

2.ການຂະຫຍາຍທີ່ບໍ່ສະເພາະ

1) ອຸນຫະພູມ annealing ຕ່ໍາເກີນໄປແລະຈໍານວນວົງຈອນແມ່ນສູງເກີນໄປ.ເພີ່ມອຸນຫະພູມ annealing ແລະຫຼຸດຜ່ອນຈໍານວນຂອງຮອບວຽນ;

2) ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງແມ່ແບບສູງເກີນໄປ.ຫຼຸດຜ່ອນປະລິມານຂອງແມ່ແບບຫຼືເຈືອຈາງແມ່ແບບ 10 ເທື່ອຫຼັງຈາກການຂະຫຍາຍ;

3) ຄວາມສະເພາະຂອງ primer ບໍ່ດີ.ເພີ່ມປະສິດທິພາບການອອກແບບ primer.

ບັນທຶກ

1.ເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການປົນເປື້ອນລະຫວ່າງຕົວຢ່າງ, ເຄື່ອງມືການເກັບຕົວຢ່າງຫຼາຍຄວນຖືກກະກຽມ, ແລະຫນ້າດິນຂອງເຄື່ອງມືສາມາດເຮັດຄວາມສະອາດດ້ວຍການແກ້ໄຂ sodium hypochlorite 2% ຫຼືເຄື່ອງເຮັດຄວາມສະອາດອາຊິດນິວເຄຼຍຫຼັງຈາກການເກັບຕົວຢ່າງແຕ່ລະຄັ້ງຖ້າຕ້ອງການໃຊ້ຊ້ໍາຊ້ອນ.

2.ມັນແນະນໍາໃຫ້ໃຊ້ແພຈຸລັງຫນູສົດ, ແລະປະລິມານຕົວຢ່າງບໍ່ຄວນໃຫຍ່ເກີນໄປເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ຜົນໄດ້ຮັບການຂະຫຍາຍ.

3.Lysis Buffer ຄວນຫຼີກລ້ຽງການແຊ່ແຂງເລື້ອຍໆ, ແລະສາມາດເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ 2 ~ 8 ℃ສໍາລັບການນໍາໃຊ້ຫຼາຍໃນໄລຍະສັ້ນ.ຖ້າເກັບຮັກສາໄວ້ໃນອຸນຫະພູມຕ່ໍາ, ຝົນອາດຈະເກີດຂຶ້ນ, ແລະຕ້ອງໄດ້ຮັບການລະລາຍຢ່າງເຕັມສ່ວນກ່ອນທີ່ຈະນໍາໃຊ້.

4.PCR Mix ຄວນຫຼີກລ້ຽງການແຊ່ແຂງເລື້ອຍໆ, ແລະສາມາດເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ 4 ℃ສໍາລັບການນໍາໃຊ້ຊ້ໍາອີກໃນໄລຍະສັ້ນ.

5.ຜະລິດຕະພັນນີ້ແມ່ນສໍາລັບການຄົ້ນຄວ້າທົດລອງວິທະຍາສາດເທົ່ານັ້ນແລະບໍ່ຄວນໃຊ້ໃນການວິນິດໄສຫຼືການປິ່ນປົວທາງດ້ານຄລີນິກ.