M-MLV Reverse Transcriptase
RevScript Reverse transcriptase ແມ່ນໄດ້ຮັບໂດຍເຕັກໂນໂລຊີວິສະວະກໍາພັນທຸກໍາ.ມັນມີຄວາມສາມາດໃນການສັງເຄາະ cDNA ທີ່ສູງຂຶ້ນ, ຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງຄວາມຮ້ອນແລະຂອບເຂດຈໍາກັດອຸນຫະພູມຕິກິຣິຍາ (ເຖິງ 60 ° C).ຜະລິດຕະພັນ cDNA ສັງເຄາະແມ່ນສູງເຖິງ 10 kb.ມັນເສີມຂະຫຍາຍຄວາມໃກ້ຊິດຂອງແມ່ແບບແລະເຫມາະສົມສໍາລັບການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບແມ່ແບບ RNA ທີ່ມີໂຄງສ້າງຂັ້ນສອງທີ່ສັບສົນຫຼືພັນທຸກໍາສໍາເນົາຕ່ໍາ.
ອົງປະກອບ
| ອົງປະກອບ | HC2003B (10,000U) | HC2003B (5*10,000U) | HC2003B (200,000U) |
| RevScript Reverse Transcriptase (200U/μL) | 50 ມລ | 5×50 ມລ | 1 ມລ |
| 5 × RevScript Buffer | 250 ມລ | 1.25 ມລ | 5 ມລ |
ເງື່ອນໄຂການເກັບຮັກສາ
ຜະລິດຕະພັນນີ້ຄວນເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -25 ° C ~ -15 ° C ເປັນເວລາ 2 ປີ.
ນິຍາມຫົວໜ່ວຍ
ໜ່ວຍໜຶ່ງລວມເອົາ 1 nmol ຂອງ dTTP ເຂົ້າໄປໃນວັດສະດຸທີ່ບໍ່ລະລາຍອາຊິດໃນ 10 ນາທີທີ່ອຸນຫະພູມ 37 ອົງສາ C ໂດຍໃຊ້ Oligo(dT) ເປັນ primers.
ການຕັ້ງຄ່າປະຕິກິລິຍາ
1.Denaturation ຂອງແມ່ແບບ RNA (ຂັ້ນຕອນນີ້ແມ່ນທາງເລືອກ, denaturation ຂອງແມ່ແບບ RNA ຊ່ວຍເປີດໂຄງສ້າງຮອງ, ເຊິ່ງຈະຊ່ວຍປັບປຸງຜົນຜະລິດຂອງ cDNA strand ທໍາອິດ.)
| ອົງປະກອບ | ປະລິມານ (μL) |
| RNase ຟຣີ ddH2O | ເຖິງ 13 |
| ໂອລິໂກ(dT)18 (50 μmol/L) ຫຼື Primer Random (50 μmol/L) ຫຼື Gene Specific Primers (2 μmol/L) | 1 |
| ຫຼື 1 | |
| ຫຼື 1 | |
| ແມ່ແບບ RNA | X a |
ໝາຍເຫດ:
1) a: ລວມ RNA: 1-5 ug ຫຼື mRNA: 1-500 ng.
2) ອົບທີ່ອຸນຫະພູມ 65°C ປະມານ 5 ນາທີ, ຫຼັງຈາກນັ້ນໂອນໃສ່ກ້ອນທັນທີທັນໃດເພື່ອແຊ່ເຢັນສໍາລັບການ 2 ນາທີ.centrifugation ໂດຍຫຍໍ້ເພື່ອເກັບກໍາຂອງແຫຼວຕິກິຣິຍາ, ຕື່ມການແກ້ໄຂປະຕິກິລິຍາ reverse transcription ດັ່ງທີ່ສະແດງຢູ່ໃນຕາຕະລາງຕໍ່ໄປນີ້.ຄ່ອຍໆ pipette ເພື່ອປະສົມ.
1.ການກະກຽມປະສົມປະຕິກິລິຍາ (ປະລິມານ 20 μL)
| ອົງປະກອບ | ປະລິມານ (μL) |
| ການປະສົມຂອງຂັ້ນຕອນທີ່ຜ່ານມາ | 13 |
| 5× Buffer | 4 |
| dNTP ສົມ (10nmol/L) | 1 |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| RNase inhibitor (40 U/μL) | 1 |
1.ປະຕິບັດປະຕິກິລິຍາພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້:
| ອຸນຫະພູມ (°C) | ເວລາ |
| 25°Ca | 5 ນາທີ |
| 42°Cb | 15-30 ນາທີ |
| 85°Cc | 5 ນາທີ |
ໝາຍເຫດ:
1) ກ.ການອົບຢູ່ທີ່ 25 ° C ເປັນເວລາ 5 ນາທີແມ່ນຕ້ອງການພຽງແຕ່ສໍາລັບການນໍາໃຊ້ hexamers ແບບສຸ່ມ.ກະລຸນາຂ້າມຂັ້ນຕອນນີ້ເມື່ອໃຊ້ Oligo (dT)18ຫຼື Gene Specific Primer.
2) ຂ.ອຸນຫະພູມ reverse transcription ແນະນໍາແມ່ນ 42 ° C, ສໍາລັບແມ່ແບບທີ່ມີໂຄງສ້າງຮອງທີ່ສັບສົນຫຼືເນື້ອໃນ GC ສູງ, ແນະນໍາໃຫ້ເພີ່ມອຸນຫະພູມຕິກິຣິຍາເປັນ 50-55 ° C.
3) ຄ.ການໃຫ້ຄວາມຮ້ອນຢູ່ທີ່ 85°C ເປັນເວລາ 5 ນາທີເພື່ອປິດການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນ.
4) ຜະລິດຕະພັນສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ໂດຍກົງໃນປະຕິກິລິຍາ PCR ຫຼື qPCR, ຫຼືເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -20 ° C ສໍາລັບການເກັບຮັກສາໄລຍະສັ້ນ.ມັນແນະນໍາໃຫ້ aliguot ຜະລິດຕະພັນແລະເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -80 ° C ສໍາລັບການເກັບຮັກສາໃນໄລຍະຍາວ.ຫຼີກເວັ້ນການແຊ່ແຂງເລື້ອຍໆ.
5) ຜະລິດຕະພັນແມ່ນເຫມາະສົມສໍາລັບຂັ້ນຕອນຫນຶ່ງ RT-qPCR, ແນະນໍາໃຫ້ເພີ່ມ 10-20 U reverse transcriptase ສໍາລັບທຸກໆລະບົບປະຕິກິລິຍາ25μL, ຫຼືຄ່ອຍໆເພີ່ມປະລິມານ reverse transcriptase ຕາມສະຖານະການຕົວຈິງ.
ບັນທຶກ
1.ກະລຸນາຮັກສາພື້ນທີ່ທົດລອງໃຫ້ສະອາດ;ຄວນໃສ່ຖົງມືທີ່ສະອາດແລະຫນ້າກາກໃນເວລາປະຕິບັດງານ.ເຄື່ອງບໍລິໂພກທັງໝົດທີ່ໃຊ້ໃນການທົດລອງຄວນຈະເປັນ RNase ຟຣີເພື່ອປ້ອງກັນການປົນເປື້ອນ RNase.
2.ຂັ້ນຕອນທັງຫມົດຄວນໄດ້ຮັບການປະຕິບັດຢູ່ເທິງກ້ອນເພື່ອປ້ອງກັນການທໍາລາຍ RNA.
3.ຕົວຢ່າງ RNA ທີ່ມີຄຸນນະພາບສູງແມ່ນແນະນໍາໃຫ້ຮັບປະກັນປະສິດທິພາບສູງຂອງການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນ.
4.ຜະລິດຕະພັນນີ້ແມ່ນສໍາລັບການນໍາໃຊ້ການຄົ້ນຄວ້າເທົ່ານັ້ນ.
5.ກະລຸນາປະຕິບັດດ້ວຍເສື້ອຄຸມຫ້ອງທົດລອງ ແລະຖົງມືທີ່ໃຊ້ແລ້ວຖິ້ມໄດ້, ເພື່ອຄວາມປອດໄພຂອງທ່ານ.
