M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase ແມ່ນ transcriptase ປີ້ນກັບກັນທີ່ໄດ້ຮັບໂດຍການກວດສອບການກາຍພັນຂອງ gene M-MLV ຂອງຕົ້ນກໍາເນີດຂອງເຊື້ອໄວຣັສ leukemia Moloney murine ແລະສະແດງອອກໃນ E.coli.ເອນໄຊເອົາກິດຈະກໍາ RNase H, ມີຄວາມທົນທານຕໍ່ອຸນຫະພູມທີ່ສູງຂຶ້ນ, ແລະເຫມາະສົມສໍາລັບການຖອດຂໍ້ຄວາມທີ່ມີອຸນຫະພູມສູງ.ດັ່ງນັ້ນ, ມັນເປັນປະໂຫຍດສໍາລັບການກໍາຈັດຜົນກະທົບທີ່ບໍ່ເອື້ອອໍານວຍຂອງໂຄງສ້າງລະດັບສູງ RNA ແລະປັດໃຈທີ່ບໍ່ສະເພາະຕໍ່ການສັງເຄາະ cDNA, ແລະມີຄວາມຫມັ້ນຄົງສູງແລະຄວາມສາມາດໃນການສັງເຄາະ reverse transcription.enzyme ມີຄວາມຫມັ້ນຄົງສູງແລະຄວາມສາມາດໃນການສັງເຄາະ transcription reverse.
ອົງປະກອບ
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × First-Strand Buffer (ເລືອກໄດ້)
* 5 × First-Strand Buffer ບໍ່ມີ dNTP, ກະລຸນາເພີ່ມ dNTPs ເມື່ອກະກຽມລະບົບຕິກິຣິຍາ.
ຄໍາຮ້ອງສະຫມັກທີ່ແນະນໍາ
1.ຂັ້ນຕອນດຽວ qRT-PCR.
2.ການກວດຫາເຊື້ອໄວຣັສ RNA.
ເງື່ອນໄຂການເກັບຮັກສາ
-20°C ສໍາລັບການເກັບຮັກສາໃນໄລຍະຍາວ, ຄວນປະສົມໃຫ້ດີກ່ອນທີ່ຈະນໍາໃຊ້, ຫຼີກເວັ້ນການ freeze ເລື້ອຍໆ.
ນິຍາມຫົວໜ່ວຍ
ໜ່ວຍໜຶ່ງລວມເອົາ 1 nmol ຂອງ dTTP ໃນ 10 ນາທີຢູ່ທີ່ 37°C ໂດຍໃຊ້ poly(A)•oligo(dT)25ເປັນແມ່ແບບ/primer.
ການຄວບຄຸມຄຸນນະພາບ
1.ຄວາມບໍລິສຸດ electrophoretic SDS-PAGE ສູງກວ່າ 98%.
2.ຄວາມອ່ອນໄຫວຂອງການຂະຫຍາຍ, ການຄວບຄຸມ batch-to-batch, ຄວາມຫມັ້ນຄົງ.
3.ບໍ່ມີກິດຈະກໍານິວເຄລຍ exogenous, ບໍ່ມີ endonuclease exogenous ຫຼື exonuclease ປົນເປື້ອນ
ການຕັ້ງຄ່າປະຕິກິລິຍາສໍາລັບການແກ້ໄຂບັນຫາຕ່ອງໂສ້ປະຕິກິລິຍາທໍາອິດ
1.ການກະກຽມປະສົມຕິກິຣິຍາ
ອົງປະກອບ | ປະລິມານ |
ໂອລິໂກ(dT)12-18 primer ຫຼື Primer Randomກ ຫຼື Gene Specific Primersb | 50 pmol |
50 pmol (20-100 pmol) | |
2 ໂມງແລງ | |
10 mM dNTP | 1 μL |
ແມ່ແບບ RNA | ລວມ RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
dH ທີ່ບໍ່ມີ RNase2O | ເຖິງ 10 μL |
ໝາຍເຫດ:a/b: ກະລຸນາເລືອກປະເພດຕ່າງໆຂອງ primers ຕາມຄວາມຕ້ອງການທົດລອງຂອງທ່ານ.
2.ໃຫ້ຄວາມຮ້ອນທີ່ 65 ອົງສາ C ເປັນເວລາ 5 ນາທີ ແລະ ເຢັນຢ່າງໄວວາໃສ່ນ້ຳກ້ອນເປັນເວລາ 2 ນາທີ.
3.ຕື່ມອົງປະກອບຕໍ່ໄປນີ້ໃສ່ລະບົບຂ້າງເທິງໃນປະລິມານທັງຫມົດ 20µL ແລະປະສົມຄ່ອຍໆ:
ອົງປະກອບ | ປະລິມານ (μL) |
5 × First-Strand Buffer | 4 |
Neoscript Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
RNase inhibitor (40 U/μL) | 1 |
dH ທີ່ບໍ່ມີ RNase2O | ເຖິງ 20 μL |
4.ກະລຸນາປະຕິບັດຕິກິຣິຍາຕາມເງື່ອນໄຂດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້:
(1) ຖ້າຫາກວ່າ Primer Random ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້, ຕິກິຣິຍາຄວນຈະໄດ້ຮັບການປະຕິບັດຢູ່ທີ່ 25℃ສໍາລັບການ 10mins, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຢູ່ທີ່ 50℃ສໍາລັບ 30 ~ 60mins;
(2) ຖ້າຫາກວ່າ Oligo dT ຫຼື primers ສະເພາະໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້, ຕິກິຣິຍາຄວນຈະໄດ້ຮັບການປະຕິບັດຢູ່ທີ່ 50 ℃ສໍາລັບການ 30 ~ 60 ນາທີ.
5.ໃຫ້ຄວາມຮ້ອນຢູ່ທີ່ 95 ℃ ເປັນເວລາ 5 ນາທີເພື່ອເປີດໃຊ້ງານ Neoscript Reverse Transcriptase ແລະຢຸດຕິກິຣິຍາ.
6.ຜະລິດຕະພັນການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນສາມາດນໍາໃຊ້ໄດ້ໂດຍກົງໃນປະຕິກິລິຍາ PCR ແລະປະຕິກິລິຍາ fluorescence PCR ປະລິມານ, ຫຼືເກັບຮັກສາໄວ້ໃນ -20 ℃ເປັນເວລາດົນນານ.
PCR Rການປະຕິບັດ:
1.ການກະກຽມປະສົມຕິກິຣິຍາ
ອົງປະກອບ | ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ |
10 × PCR Buffer (dNTP ຟຣີ, Mg²+ ຟຣີ) | 1× |
dNTPs (10mM ແຕ່ລະ dNTP) | 200 ມມ |
25 ມມ MgCl2 | 1-4 ມມ |
Taq DNA Polymerase (5U/μL) | 2-2.5 U |
primer 1 (10 μM) | 0.2-1 ມມ |
primer 2 (10 μM) | 0.2-1 ມມ |
ແມ່ແບບກ | ≤10% First Chain Reaction Solution (2 μL) |
ddH2O | ເຖິງ 50 μL |
ໝາຍເຫດ:a: ຖ້າສານປະຕິກິລິຍາຕ່ອງໂສ້ທໍາອິດຖືກເພີ່ມຫຼາຍເກີນໄປ, ປະຕິກິລິຍາ PCR ອາດຈະຖືກຍັບຍັ້ງ.
2.ຂັ້ນຕອນປະຕິກິລິຍາ PCR
ຂັ້ນຕອນ | ອຸນຫະພູມ | ເວລາ | ຮອບວຽນ |
ກ່ອນການເກີດຜິວໜັງ | 95℃ | 2-5 ນາທີ | 1 |
ລັກສະນະ | 95℃ | 10-20 ວິ | 30-40 |
ການຫົດຕົວ | 50-60℃ | 10-30 ວິ | |
ສ່ວນຂະຫຍາຍ | 72 ℃ | 10-60 ວິ |
ບັນທຶກ
1.ທີ່ເຫມາະສົມສໍາລັບການປັບປຸງອຸນຫະພູມ transcription reverse ໃນລະດັບຂອງ 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.ມັນມີຄວາມຫມັ້ນຄົງທີ່ດີກວ່າ, ແມ່ນເຫມາະສົມສໍາລັບອຸນຫະພູມສູງ reverse amplification.ນອກຈາກນັ້ນ, ມັນແມ່ນເອື້ອອໍານວຍສໍາລັບການປະສິດທິພາບຜ່ານພາກພື້ນໂຄງສ້າງສະລັບສັບຊ້ອນຂອງ RNA.ນອກຈາກນີ້, ມັນເໝາະສຳລັບການກວດຫາ RT-PCR ແບບ Multiplex fluorescence.
3.ຄວາມເຂົ້າກັນໄດ້ດີກັບ enzymes ຂະຫຍາຍ PCR ຕ່າງໆແລະເຫມາະສົມກັບປະຕິກິລິຍາ RT-PCR ທີ່ມີຄວາມອ່ອນໄຫວສູງ.
4.ເຫມາະສໍາລັບຄວາມອ່ອນໄຫວສູງຫນຶ່ງຂັ້ນຕອນ fluorescence ປະລິມານຕິກິຣິຍາ RT-PCR, ປະສິດທິຜົນປັບປຸງອັດຕາການກວດພົບຂອງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຕ່ໍາຂອງແມ່ແບບ.
5.ເຫມາະສໍາລັບການກໍ່ສ້າງຫ້ອງສະຫມຸດ cDNA.