ຊຸດ EndoFree Plasmid Maxi
ຊຸດນີ້ແມ່ນເຫມາະສົມສໍາລັບການສະກັດເອົາຈາກ 150 - 300 ມລຂອງການແກ້ໄຂເຊື້ອແບັກທີເຣັຍໃນຄືນ, ໂດຍນໍາໃຊ້ວິທີການປັບປຸງ SDS-alkaline lysis ເພື່ອ lyse ເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ.ສານສະກັດຈາກນໍ້າມັນດິບແມ່ນໄດ້ຖືກຄັດເລືອກດ້ວຍສານສະກັດຈາກ Endotoxin Scavenger ທີ່ເປັນເອກະລັກແລະແຍກອອກໂດຍການຫມູນວຽນເພື່ອກໍາຈັດສານ endotoxins.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ເຍື່ອ silica gel ເລືອກຜູກມັດກັບ plasmid DNA ໃນການແກ້ໄຂພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂຂອງເກືອສູງແລະ pH ຕ່ໍາ.ອັນນີ້ປະຕິບັດຕາມດ້ວຍການຕື່ມການລ້າງ buffer ເພື່ອເອົາສິ່ງສົກກະປົກແລະສ່ວນປະກອບຂອງແບັກທີເລຍອື່ນໆ.ສຸດທ້າຍ, ທາດເກືອຕ່ໍາ, pH buffer ສູງຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອ elute DNA plasmid ບໍລິສຸດຈາກເຍື່ອຊິລິໂຄນ matrix.ເຍື່ອ silica gel ໃຊ້ເຍື່ອ adsorption ພິເສດ, ແລະຄວາມແຕກຕ່າງຂອງປະລິມານການດູດຊຶມລະຫວ່າງຄໍລໍາແລະຄໍລໍາແມ່ນນ້ອຍຫຼາຍແລະການເຮັດຊ້ໍາອີກແມ່ນດີ.ຟີນອລ, chloroform ແລະສານຕ້ານອະນຸມູນອິດສະລະອື່ນໆແມ່ນບໍ່ຈໍາເປັນ, ແລະບໍ່ແມ່ນຂັ້ນຕອນການຝົນຂອງເອທານອນ.ຊຸດນີ້ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອສະກັດຢ່າງໄວວາ 0.2 -1.5 ມລກຂອງ plasmid DNA ທີ່ບໍລິສຸດ, ມີອັດຕາການສະກັດຈາກ 80% -90%.ຊຸດດັ່ງກ່າວໃຊ້ສູດຂະບວນການທີ່ເປັນເອກະລັກກໍາຈັດ endotoxin, ເນື້ອໃນຂອງ endotoxin ແມ່ນຕໍ່າທີ່ສຸດແລະຜົນກະທົບຂອງການຖ່າຍທອດຈຸລັງແມ່ນດີເລີດ.plasmid ທີ່ສະກັດອອກມາສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ໂດຍກົງໃນການຍ່ອຍອາຫານຂອງ enzyme, PCR, in vitro transcription, transformation, sequencing and other molecular biology tests.
ເງື່ອນໄຂການເກັບຮັກສາ
RNaseA ຄວນຖືກເກັບໄວ້ຢູ່ທີ່ -30 ~ -15℃ ແລະການຂົນສົ່ງທີ່ ≤0℃ .
Endotoxin Scavenger ສາມາດເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ 2 ~ 8℃ສໍາລັບການຫນຶ່ງເດືອນ, ເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -30 ~ -15℃ສໍາລັບການເກັບຮັກສາໃນໄລຍະຍາວ.ແລະການຂົນສົ່ງຢູ່ທີ່ ≤0℃ .
ສ່ວນປະກອບອື່ນໆຄວນຖືກເກັບໄວ້ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ (15 ~ 25 ℃) ແລະຂົນສົ່ງໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.
ອົງປະກອບ
| ອົງປະກອບ | 10RXNS |
| RNase A | 750 ມລ |
| Buffer P1 | 75 ມລ |
| Buffer P2 | 75 ມລ |
| Buffer P4 | 75 ມລ |
| ເຄື່ອງຂູດ Endotoxin | 25 ມລ |
| Buffer PW | 2×22 ມລ |
| Buffer TB | 20 ມລ |
| ຖັນ FastPure DNA Maxi (ແຕ່ລະອັນໃນທໍ່ເກັບ 50ml) | 10 |
| ທໍ່ເກັບລວບລວມທີ່ບໍ່ມີ endotoxin | 2×5 |
RNaseA:10 mg/ml, ໃຊ້ເພື່ອເອົາ RNA ອອກ.
Buffer P1:buffer suspension ເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ, ເພີ່ມ RNaseA ໃສ່ Buffer P1 ກ່ອນທີ່ຈະໃຊ້ຄັ້ງທໍາອິດ.
Buffer P2:buffer lysis ເຊື້ອແບັກທີເລຍ (ປະກອບດ້ວຍ SDS/NaOH).
Buffer P4:neutralizing buffer.
ເຄື່ອງຂູດ Endotoxin:ເອົາ endotoxin ອອກຢ່າງມີປະສິດທິພາບຈາກສານສະກັດຈາກ plasmid ດິບ.
Buffer PW:ລ້າງ buffer, ເພີ່ມປະລິມານທີ່ກໍານົດຂອງເອທານອນກ່ອນທີ່ຈະນໍາໃຊ້ຄັ້ງທໍາອິດ.
Buffer TB:buffer elution.
ຖັນ FastPure DNA Maxi:ຖັນການດູດຊຶມ DNA plasmid.
ທໍ່ເກັບ 50 ml:ທໍ່ເກັບລວບລວມການກັ່ນຕອງ.
ທໍ່ເກັບລວບລວມທີ່ບໍ່ມີ endotoxin:ທໍ່ເກັບລວບລວມ DNA plasmid.
ວັດສະດຸກະກຽມ
ເອທານອນຢ່າງແທ້ຈິງ, isopropanol, 50 ml ທໍ່ centrifuge ລຸ່ມແລະ 50 ml ທີ່ບໍ່ມີ endotoxin.ທໍ່ centrifuge.
ຄໍາຮ້ອງສະຫມັກ
ຜະລິດຕະພັນນີ້ແມ່ນເຫມາະສົມສໍາລັບການສະກັດເອົາຂະຫນາດໃຫຍ່ຂອງ plasmids ຈາກ 150 - 300 ml ຂອງການແກ້ໄຂແບັກທີເລຍ.ວັດທະນະທໍາຄືນ.
ຂະບວນການທົດລອງ
1. ເອົາ 150 – 200 ມລ (ບໍ່ເກີນ 300 ມລ) ຂອງສານຂ້າເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ ຝັງຄ້າງຄືນ ແລະ ບີບອັດໃສ່.ປະມານ 11,000 rpm (12,000 × g) ສໍາລັບ 1 – 2 ນາທີ.ຖິ້ມ supernatant ແລະເກັບກໍາເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ.
Δໃນເວລາທີ່ເກັບກໍາຫຼາຍກ່ວາ 50 ml ຂອງການແກ້ໄຂເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ, ເຊື້ອແບັກທີເຣັຍສາມາດໄດ້ຮັບການເກັບກໍາໂດຍການເພີ່ມການແກ້ໄຂແບັກທີເລຍ, centrifugation, ຖິ້ມ supernatant ແລະຂັ້ນຕອນອື່ນໆໃນທໍ່ 50 ml ດຽວກັນສໍາລັບການ.
ຫຼາຍຄັ້ງ.
2. ຕື່ມ Buffer P1 7.5 ມລ (ກະລຸນາກວດເບິ່ງວ່າ RNaseA ໄດ້ຖືກເພີ່ມໃສ່ Buffer P1) ເຂົ້າໄປໃນຈຸດສູນກາງຫຼືບໍ່.ທໍ່ທີ່ມີເຊື້ອແບັກທີເຣັຍແລະປະສົມຢ່າງລະອຽດໂດຍ vortex ຫຼື pipetting.
Δການ resuspension ສົມບູນຂອງເຊື້ອແບັກທີເຣັຍໃນຂັ້ນຕອນນີ້ແມ່ນສໍາຄັນຕໍ່ຜົນຜະລິດ, ແລະບໍ່ຄວນມີກຸ່ມແບັກທີເລຍຫຼັງຈາກ resuspension.ຖ້າມີກຸ່ມແບັກທີເລຍທີ່ບໍ່ໄດ້ປະສົມຢ່າງລະອຽດ, ມັນຈະສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ lysis, ເຮັດໃຫ້ຜົນຜະລິດຕ່ໍາແລະຄວາມບໍລິສຸດ.ຖ້າ OD600 ຂອງການແກ້ໄຂແບັກທີເລຍແມ່ນ 0.65, ແນະນໍາໃຫ້ໃຊ້ Buffer P1 7.5 ມລໃນເວລາທີ່ສະກັດຈາກ 150 ມລຂອງການແກ້ໄຂແບັກທີເລຍ;ເມື່ອ OD600 ເປັນ 0.75, 8 ມລຂອງ Buffer P1 ຄວນຖືກນໍາໃຊ້ແລະປະລິມານຂອງ Buffers P2 ແລະ P4 ຄວນມີການປ່ຽນແປງຕາມຄວາມເຫມາະສົມ.ຖ້າປະລິມານຂອງສານຕ້ານເຊື້ອແບັກທີເລຍເພີ່ມຂຶ້ນເຖິງ 200 ມລ, ແນະນໍາໃຫ້ໃຊ້ປະລິມານຂອງ Buffers P1, P2, ແລະ P4 ເພີ່ມຂຶ້ນຕາມອັດຕາສ່ວນ.
3. ຕື່ມ Buffer P2 7.5 ມລ ເຂົ້າໃນການລະງັບເຊື້ອແບັກທີເລຍຈາກຂັ້ນຕອນທີ 2 ແລະປະສົມຄ່ອຍໆຂຶ້ນ ແລະ ລົງປະມານ 6 – 8ເວລາແລະ incubate ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງສໍາລັບ 4-5 ນາທີ.
Δ Invert ຄ່ອຍໆເພື່ອປະສົມຢ່າງລະອຽດ.Vortexing ຈະເຮັດໃຫ້ການແບ່ງແຍກ DNA ຂອງພັນທຸກໍາ, ສົ່ງຜົນໃຫ້ຊິ້ນ DNA genomic ໃນ plasmid ສະກັດ.ໃນເວລານີ້, ການແກ້ໄຂຈະກາຍເປັນ viscous ແລະ translucent, ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າເຊື້ອແບັກທີເຣັຍໄດ້ຖືກ lysed ຢ່າງເຕັມສ່ວນ.ໄລຍະເວລາບໍ່ຄວນເກີນ 5 ນາທີເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການທໍາລາຍຂອງ plasmids.ຖ້າການແກ້ໄຂບໍ່ຊັດເຈນ, ອາດຈະມີເຊື້ອແບັກທີເຣັຍຫຼາຍເກີນໄປເຮັດໃຫ້ເກີດlysis ທີ່ບໍ່ຄົບຖ້ວນ, ດັ່ງນັ້ນປະລິມານຂອງເຊື້ອແບັກທີເຣັຍຄວນໄດ້ຮັບການຫຼຸດລົງຢ່າງເຫມາະສົມ.
4. ຕື່ມ Buffer P4 7.5 ມລ ເຂົ້າໃນການລະງັບເຊື້ອແບັກທີເຣັຍຈາກຂັ້ນຕອນທີ 3 ແລະ ຄ່ອຍໆປີ້ນກັບທັນທີ 6 – 8 ເທື່ອ ເພື່ອເຮັດໃຫ້ການແກ້ໄຂ Buffer P2 ເປັນກາງຢ່າງສົມບູນ.ໃນເວລານີ້, precipitate flocculent ສີຂາວຄວນຈະປາກົດ.Centrifuge ທີ່ຫຼາຍກວ່າປະມານ 11,000 rpm (12,000 × g) ສໍາລັບ 10 – 15 ນາທີ, ລະມັດລະວັງ pippette supernatant ເຂົ້າໄປໃນທໍ່ centrifuge ຮອບລຸ່ມ 50 ml ໃຫມ່ (ກະກຽມດ້ວຍຕົນເອງ), ແລະຫຼີກເວັ້ນການດູດເອົາຝົນສີຂາວທີ່ລອຍ.
Δ ເພີ່ມ Buffer P4 ແລະທັນທີທັນໃດ invert ເພື່ອປົນກັນ.ປ່ອຍທໍ່ນັ້ນໃຫ້ຢືນຢູ່ ຈົນກ່ວານ້ຳຝົນສີຂາວຖືກແຈກຢາຍຢ່າງສະໝ່ຳສະເໝີຕະຫຼອດການແກ້ໄຂບັນຫາເພື່ອປ້ອງກັນການຜະລິດຝົນທີ່ຕົກຢູ່ໃນທ້ອງຖິ່ນທີ່ອາດສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ການເປັນກາງ.ຖ້າຫາກວ່າບໍ່ມີ precipitate flocculent ສີຂາວເປັນເອກະພາບກ່ອນທີ່ຈະ centrifugation ແລະ supernatant ແມ່ນບໍ່ຈະແຈ້ງຫຼັງຈາກການ centrifugation, ທໍ່ສາມາດເປັນ.centrifuged ອີກ 5 ນາທີ.
5. ຕື່ມ 0. 1 ເທົ່າຂອງປະລິມານ (10% ຂອງປະລິມານ supernatant, ປະມານ 2.2 ml) ຂອງ Endotoxin Scavenger ກັບ supernatant ຈາກຂັ້ນຕອນທີ 4 ແລະ invert ກັບປະສົມ.ເອົານ້ຳໃສ່ໃນອາບນ້ຳກ້ອນ ຫຼືໃສ່ນ້ຳກ້ອນບົດ (ຫຼືຕູ້ແຊ່ເຢັນ) ປະມານ 5 ນາທີ ຈົນກ່ວາສານລະລາຍປ່ຽນຈາກຂີ້ຝຸ່ນໄປເປັນກະຈ່າງແຈ້ງ (ຫຼືຍັງ.ຂົມເລັກນ້ອຍ), ແລະບາງຄັ້ງປະສົມຫຼາຍຄັ້ງ.
Δ ຫຼັງຈາກ Endotoxin Scavenger ໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໄປໃນ supernatant, supernatant ຈະກາຍເປັນ turbid ແຕ່ໄດ້.supernatant ຄວນກາຍເປັນທີ່ຈະແຈ້ງ (ຫຼື turbid ເລັກນ້ອຍ) ຫຼັງຈາກເຢັນໃນອາບນ້ໍາກ້ອນ.
6. ຫຼັງຈາກນຳເອົາສານຊຸບເປີນາແຕນໄປວາງໄວ້ທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງ (> 25 ℃) ປະມານ 10 – 15 ນາທີ, ມັນຈະກາຍເປັນຂີ້ເທົ່າ.ອຸນຫະພູມຂອງມັນເພີ່ມຂຶ້ນເຖິງອຸນຫະພູມຫ້ອງ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, supernatant ຄວນໄດ້ຮັບການ inverted ເພື່ອປະສົມ.
Δຖ້າອຸນຫະພູມຫ້ອງຕ່ໍາຫຼືທ່ານຕ້ອງການຫຼຸດຜ່ອນເວລາການສະກັດເອົາ, supernatant ສາມາດ incubated ໃນອາບນ້ໍາ 37 ~ 42 ℃ສໍາລັບ 5 – 10 min ແລະຂັ້ນຕອນຕໍ່ໄປສາມາດປະຕິບັດໄດ້ຫຼັງຈາກ supernatant ໄດ້.ກາຍເປັນ turbid.
7. Centrifuge the supernatant at about 11,000 rpm (12,000 × g) for 10 min at room temperature (ອຸນຫະພູມຈະຕ້ອງ >25℃) ເພື່ອແຍກໄລຍະ.ໄລຍະທີ່ມີນ້ໍາເທິງປະກອບດ້ວຍ DNA ໃນຂະນະທີ່ຊັ້ນນ້ໍາສີຟ້າຕ່ໍາມີ endotoxin ແລະສິ່ງປົນເປື້ອນອື່ນໆ.ໂອນໄລຍະທີ່ມີນ້ໍາ DNA ໄປສູ່ທໍ່ໃຫມ່ແລະຖິ້ມຊັ້ນໄຂມັນ.
Δອຸນຫະພູມໃນລະຫວ່າງການ centrifugation ຈະຕ້ອງເກີນ 25 ℃ຍ້ອນວ່າການແຍກໄລຍະປະສິດທິຜົນບໍ່ໄດ້ເກີດຂື້ນຖ້າອຸນຫະພູມຕໍ່າເກີນໄປ.
Δຖ້າການແຍກໄລຍະບໍ່ມີປະສິດທິພາບ, ອຸນຫະພູມ centrifugation ສາມາດປັບໄດ້ເຖິງ 30 ℃ແລະເວລາຂອງການ centrifugation ສາມາດເພີ່ມຂຶ້ນເຖິງ 15 ນາທີ.
Δຢ່າດູດເອົາຊັ້ນນ້ໍາມັນສີຟ້າຍ້ອນວ່າມັນມີ endotoxin ແລະສິ່ງປົນເປື້ອນອື່ນໆ.
ກົນໄກ
Resuspension Lysis Neutralization
◇ ເພີ່ມ Buffer P1 7.5 ml
◇ ເພີ່ມ Buffer P2 7.5 ml
◇ ເພີ່ມ Buffer P4 7.5 ml
ການກໍາຈັດ Endotoxin
◇ ຕື່ມ 0. 1 ເທົ່າຂອງປະລິມານ supernatant ຂອງ Endotoxin Scavenger
ການຜູກມັດແລະການຊັກ
◇ ເພີ່ມ 0.5 ເທົ່າຂອງປະລິມານຂອງ isopropanol
◇ ເພີ່ມ Buffer PW 10 ml
◇ ເພີ່ມ Buffer PW 10 ml
Elution
◇ ເພີ່ມ Buffer TB 1 – 2 ml ຫຼື ddH2O ທີ່ບໍ່ມີ endotoxin
